1、分类号密级编号硕硕士士学学位位论论文文肺癌的基因突变检测方法研究研究生姓名汤丽梦指导教师姓名职称李凯教授郭紫芬副教授学科专业名称药理学研究方向分子药理学年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学。
2、粒和缺失突变型质粒利用蓝白筛选检测结果组织模板的鉴定利用分子开关检测结果阴性样本的测序鉴定.万方数据讨论.实验结论.参考文献.综述.硕士期间研究成果致谢.万方数据主要英文缩略语索引英文缩写英文全称中文全称表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂脱氧核糖核酸循环阈值聚合酶链反应单核苷酸的多态性脱氧核糖核苷三磷酸低保真度聚合酶高保真度聚合酶碱性磷酸酶非小细胞肺癌乙二胺四乙酸醋酸钠异丙基硫代半乳糖苷氨苄西林转分钟碱基对万方数据肺癌的基因突变检测方法研究中文摘要目的探讨利用相关基因插入片段阅读框是否含有终止密码子结合蓝白筛选检测基因缺失突变的可行性，利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关检测基因热点突变，从而指导肺癌患者酪氨酸激酶抑制剂的合理用药。方法在中查找基因号外显子野生型基因序列，查找质粒基因序列，根据文献已经报道过的常见的致病突。
3、变和，设计普通引物和硫化修饰检测引物，利用重叠延伸方法构建野生型质粒模板和突变质粒模板突变质粒模板，蓝白筛选转化野生质粒和缺失突变质粒，随后对份临床肺癌病人血中游离样本进行蓝白筛选，检测是否含有基因或突变,并测序鉴定蓝白筛选方法的可靠性。随后我们对份临床组织样本进行鉴定，最后用本课题组开发的高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关分别结合琼脂糖凝胶电泳与荧光定量技术分别对份临床组织样本进行基因或突变的定性与定量检测。结果在显色固体培养基上，野生质粒的菌落均为白色，而，突变质粒的菌落均为蓝色。份临床血中游离样本构建的重组质粒菌落颜色均为大量白色，少量蓝色，挑选蓝色菌落进行测序，可以检测出含有缺失，未检出缺失，对检出缺失突变对应的肺癌组织样本进行测序验证，显示组织样本基因存在缺失突变，与蓝白筛选结果吻合。高保真聚合酶介导的分子开关。
4、以减少患者不必要的经济和精神负担，指导类药物的合理使用，为患者提供个体化用药的科学依据。表.药物对突变肺癌病人的治疗效果作者筛查样本数例突变样本数例使用药物总有效率吉非替尼厄罗替尼吉非替尼吉非替尼吉非替尼吉非替尼吉非替尼万方数据然而基因突变的检测并非易事，体细胞突变基因与野生型基因差异不大，有时甚至只有个碱基的差别，而且体细胞突变非常稀少，容易被样本中大量存在的野生型基因干扰，这就要求检测方法必须具有很高的灵敏度和特异性。目前常用的突变检测方法有直接测序法单链构象多态性突变体富集探针扩增阻滞突变系统微数字高分辨率熔解曲线变性高压液相色谱等。其中直接测序法可以说是最准确直观的方法，但是直接测序法的敏感性低，容易造成假阴性，而其他方法也各有其优缺点，科学家们还在致力于寻找更加简便经济准确的方法来解决这难题。导师李凯教授提出了两。
5、酶消化的硫化修饰引物，并在引物上引入突变位点，当该引物与野生型模板配对时，发生错配，但是高保真聚合酶无法进行校正，因此引物无法延伸，不能得到目的条带，而当该引物与突变型模板配对时，引物与模板配对正确因此可以得到正确的产物，通过这种有产物或者无产物的的直观辨认，就可以判断基因组是否发生了突变。利用该分子开关，本课题组已经成功检测出小缺失突变，神经性耳聋中点突变和地中海贫血基因突变等。本实验将对上述两种检测基因突变的方法进行验证与评估。第种蓝白筛选方法中采用血中游离为模板检测号外显子和缺失突变。第二万方数据种突变敏感性分子开关偶联琼脂糖凝胶电泳检测号外显子缺失突变并结合荧光定量尝试对缺失突变进行定性与定量检测，为快速筛查基因突变并指导肺癌病人临床用药提供依据。万方数据实验材料．主要仪器型恒温水槽上海精宏实验设备有限公司型隔水式。
6、聚合酶连接酶万方数据.耗材塑料次性无菌培养皿美国康宁公司次性无菌离心管美国康宁公司.管枪头.其他琼脂糖琼脂粉酵母提取物购自生工生物工程上海有限公司胰蛋白胨购自英国醋酸氯化钠无水乙醇等试剂为国产分析纯。万方数据实验方法．主要溶液的配置.缓冲液称取加入烧杯中，再加入.的醋酸，用去离子水定容至，搅拌溶解，充分混匀，室温保存。.缓冲液用量筒量取缓冲液，倒入烧杯中，用去离子水定容至，混匀，室温保存。.液体培养基称取酵母提取物胰蛋白胨加入烧杯中，再加入去离子水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，倒入蓝盖瓶中高压灭菌保存。.抗性显色固体培养基取液体培养基，加入琼脂粉，高压灭菌,在水浴中放置冷却至，再加入显色固体培养基需再加入和，充分摇匀，倒入培养皿，每个培养皿约倒入,待冷却凝固以后，倒置于冰箱保存。二．相关生物信息学软件与网站.引物设计软件综合序。
7、列分析软件序列分析软件.美国国立生物技术信息中心三．引物设计.构建突变质粒和野生质粒所用引物根据上登陆的人类基因野生型序列号外显子缺失突变序万方数据列和号外显子点突变序列，利用.软件设计普通引物。其中,用于构建野生质粒，长度为用于构建缺失的突变质粒用于构建缺失的突变质粒蓝白筛选所用引物根据上登陆的人类基因野生型序列，并在引物上引入，酶切位点，利用.软件设计普通引物。下划线为酶切位点下划线为酶切位点.分子开关所用检测引物根据分子开关原理以及基因外显子缺失序列设计硫化修饰引物以及公用的反向引物。其中加粗且带有下划线标记的为突变位点，处为硫化修饰位置，和公共反向引物检测基因号外显子缺失，长度为，和公共反向引物检测基因号外显子缺失，长度为。万方数据四．模板和样品采集.血液基因组模板采集于苏大附二院采集两管正常人血液，置于抗凝管中保。
8、恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司电子天平北京仪器有限公司型电泳仪上海六仪器厂漩涡混合器上海琪特分子仪器有限公司迷你离心机上海卢湘仪仪器有限公司超低温冰箱日本三洋超纯水器恒宇电热恒温干燥箱上海跃进医疗器械厂单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司常温离心机公司德国移液枪.公司德国高速冷冻离心机苏州中佳精密器械有限公司普通仪公司美国荧光定量仪公司美国凝胶成像系统公司美国灭菌锅上海博迅实业有限公司制冰机细菌摇床上海卢湘仪仪器有限公司万方数据二．主要试剂及来源感受态细胞购自北京天根公司。.普通引物和硫化修饰引物均由上海生工合成。.试剂盒载体试剂盒货号日本公司血液细胞组织基因组提取试剂盒离心柱型货号北京天根公司质粒小提试剂盒离心柱型货号北京天根公司通用型纯化回收试剂盒离心柱型货号北京天根公司货号德国凯杰公司测序试剂盒.货号.酶类试剂。
9、种检测突变的方法，种是利用相关基因插入片段阅读框是否含有终止密码子结合蓝白筛选检测基因突变。上的基因编码肽，与大肠杆菌基因组编码的多肽互补形成四聚体，生成有活性的，它能催化底物从而使大肠杆菌在固体显色培养基上生成蓝色菌落，当基因的阅读框发生移码，或者在其内插入终止密码子时，基因不会生成肽，因此不能催化底物，生成菌落为白色。而号外显子两种突变缺失的序列和序列中，正好缺失了个终止子，因此利用蓝白筛选原理便能将号外显子野生型和缺失型区分开来，野生型基因制备的重组质粒应长白色菌落，而含有缺失突变基因制备的重组质粒应长蓝色菌落。第二种方法是利用高保真酶介导的分子开关来检测基因突变，高保真聚合酶具有聚合酶活性和外切酶活性，当引物与模板不配对时，高保真聚合酶可以切除错配的碱基使其与模板重新配对使引物继续延伸。利用该原理，课题组使用种耐外。
10、受体在许多人类肿瘤中都存在高表达。旦被激活，便能促进肿瘤细胞的繁殖生长修复和存活，抑制的激活能起到抑制肿瘤的目的。这种原理在肺癌中同样适用，特别是。受体抑制剂主要是单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂其中的代表药物有吉非替尼和厄罗替尼，它们可以阻断的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。不过大量临床实验表明，这两种药物在不同个体之间会产生明显的治疗差异，研究发现络氨酸激酶区域基因突变是产生治疗差异的主要原因，发生的突变的更易结合使其对更加敏感从而加强了药物的疗效。基因突变的主要位置位于为号外显子和号外显子，占突变总数的，其中号外显子中主要为两种突变，号外显子主要为点突变。大量临床研究表明，吉非替尼和厄罗替尼对具有上述突变的病人疗效显著表。因此通过基因检测筛选出对该药物敏感的患者，。
11、合琼脂糖凝胶电泳检测份临床肺癌组织样本显示，样本号未检测到基因缺失，其余均检测出基因缺失，且所有样本均未为检测出基因缺失。分子开关结合荧光定量结果显示除号样本外所有样本均出现基因缺失，拷贝数在左右，另外显示除号样本外均检测出基因缺失，但拷贝数均小于。万方数据结论利用相关基因插入片段阅读框是否含有终止密码子结合蓝白筛选检测基因突变是种可行的方法突变敏感性分子开关技术与荧光定量技术结合能对基因突变进行定性和定量分析，可能是种敏感性很高的检测方法。关键词，蓝白筛选，高保真酶，分子开关肺癌万方数据,.,“”,.,.,.,.,,万方数据.,.,””万方数据引言肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之，其中非小细胞肺癌，占肺癌总数的。科学们在进行肿瘤研究时逐渐发现，在细胞信号转导通路中起重要作用的表皮生长因子。
12、有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录主要英文缩略语索引中文摘要引言.实验材料主要仪器主要试剂及来源.实验方法主要溶液的配置相关生物信息学软件与网站引物设计模板和样品采集构建突变质粒和野生质粒利用原核蓝白筛选检测血中游离缺失突变利用分子开关检测基因组突变实验结果构建野生型。
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高尔夫球规则知识介绍PPT讲稿 编号41