流行性感冒病毒Vero细胞繁殖研究 ㊣ 精品文档 值得下载

诚挚的谢意，首先衷心感谢孙洪雁老师四年来对我辛勤的培养和谆谆的教诲，在老师身上我学会了如何将知识深入浅出，如何理论联系实际，更让我体会到了老师热爱教育事业心系学生心怀博大严谨务实，兢兢业业这些高尚的品格，让我铭记并学习终生。

本实验过程中得到了老师的极大支持和无私帮助，以及同学对我的热心帮助，在此并表示衷心的感谢，外文文献，，，，。

内瓦召开了关于细胞培养物作为生产流感疫苗的基质的会议，讨论了几个实验室关于流感病毒在稳定细胞系中培养的研究结果，并对下步工作提出了建议。

此后，细胞流感疫苗的研究取得了飞速发展。

等发现，流感病毒在几种传代细胞系中的复制可因培养液中胰蛋白酶的快速灭活而受到影响等比较了株流感病毒在细胞培养物中的繁殖能力和生长特性后，认为流感病毒在细胞培养物和鸡胚中的复制能力具有显著差异等研究发现，倘若在感染后以适当间隔加入胰蛋白酶，细胞可用于最初的分离及人甲型和乙型流感病毒复制。

不管是经细胞还是鸡胚培养的疫苗，只有鼻内接种活病毒疫苗的小鼠才检出病毒特异性分泌型抗体。

细胞培养的流感疫苗诱导的细胞增殖应答和型细胞因子的释放明显高于鸡胚培养的疫苗。

研究证实细胞培养的流感疫苗与鸡胚培养的流感疫苗在诱导体液免疫应答方面免疫原性相仿，而在诱导细胞免疫应答方面，前者优于后者。

并且细胞培养系统可以直接利用流感野毒株进行生产，能够对年中任何时间发生的流行病或大流行均作出快速应答，而不像鸡胚生产首先要制备高生长的重组株需周，并能避免污染的鸡胚可能影响生物负荷和疫苗内毒素含量危险。

而且在哺乳动物细胞中生长的流感病毒比鸡胚培养分离的病毒更接近于临床样本中的病毒。

因此具有效果好产量高生产迅速起始材料易于控制易于标准化生产环境密闭以及保证的稳定性和免疫原性等优点。

未来几年内，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋。

世界卫生组织美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗，目前国内还没有向国家食品药品监督管理局申请哺乳动物细胞生产流感疫苗的报道。

流感疫苗的研究现状目前国内外正在研制的流感疫苗主要有减毒活疫苗基因工程疫苗核酸疫苗通用疫苗等类型。

针对流感疫苗的研究热点主要是开发不同的佐剂如，等不同的免疫途径不同的抗原组成及含量的安全性和免疫原性及保护效果等。

展望未来几年内，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋。

世界卫生组织美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。

为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资亿美元资助葛兰素史克诺华和巴斯德个主要的流感疫苗开发新技术。

作为个流感大国，我国更应加强在在这方面的研究工作，以应对突发的流感暴发流行。

第二章流感病毒于细胞内的适应性研究胰酶浓度对流感病毒在细胞内繁殖的影响研究材料流感病毒。

细胞细胞其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺生理盐水液主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜超低温冰柜家用冰箱刻度吸管血凝板加液槽漩涡振荡器细胞培养瓶方法选择生长良好的单层细胞，分组编号后，弃旧培养液，用液洗涤细胞面三遍，控净液体，按组接种含的胰酶的流感毒病液，置吸附适宜时间后，补加维持液，置培养天，收获细胞培养物，检测其血凝效价。

结果见表。

表流感病毒不同胰酶浓度的研究结果胰蛋白酶浓度不同亚型流感病毒结果由表可见，当胰酶浓度为时，流感病毒在细胞内的效价最高。

流感病毒最佳感染量的研究流感病毒。

细胞细胞。

其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺生理盐水液主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜超低温冰柜家用冰箱刻度吸管血凝板加液槽漩涡振荡器细胞培养瓶方法选择生长良好的单层细胞，按试验分组进行编号后，弃旧培养液，用液洗涤细胞面，控净液体，按组接种经稀释的流感毒种继续培养。

病毒收获当细胞病变达到左右时，选择无污染的细胞培养瓶，收获病毒液。

分装将收获的病毒液以无菌方法合并，分装。

抽取检定用样品后，置以下冻存。

结果采用上述方法，将各毒株在细胞内连续传代，共计代。

各毒株在细胞内的传代谱系及检测结果相见表。

由表可见，流感病毒在细胞内连续传代，自第代后，流感病毒血凝滴度均在以上。

表在细胞内传代稳定性结果检定项目及结果传代谱系鉴别试验无菌检查支原体检查血凝效价合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格表在细胞内传代稳定性结果检定项目及结果传代谱系鉴别试验无菌检查支原体检查血凝效价合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格表在细胞内传代稳定性结果检定项目及结果传代谱系鉴别试验无菌检查支原体检查血凝效价合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格结论流行性感冒以下简称流感是由甲乙丙三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，其重要性在于可引起严重的发病率和死亡率，影响学校公共服务机构和各单位的正常工作。

超额死亡率也与流感有关，死亡者多为患有慢性疾病和年迈体衰的老年人。

目前唯可行的流感预防措施是疫苗接种。

流感灭活疫苗已被广泛使用了近年。

免疫的效果随环境而变化，但直报告有的保护率为。

存在的差异来自流行株抗原的持续变异及在不同的宿主细胞中些病毒亚群优先生长造成。

因此，世界卫生组织于对流感灭活疫苗生产和检定的建议系列技术报告中增加了利用哺乳动物细胞进行病毒分离和疫苗生产的内容。

目前，被世界卫生组织推荐作为流感灭活疫苗生产用细胞基质主要有细胞细胞及细胞。

其中细胞已成功用于人用狂犬病疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗乙型脑炎灭活疫苗等的生产。

本文通过广泛的文献检索与反复试验，研究了流感病毒于细胞内的适应性传代遗传稳定性，为进步研制流感病毒灭活疫苗细胞打下了良好的基础。

参考文献戚凤春盛军流感疫苗的研究进展中国生物制品学杂志郭元吉程小雯流行性感冒病毒及其实验技术北京中国三峡出版社，侯云德舒跃龙李德新发展中国家预防流感大流行的策略中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，张华捷编译张庶民审校流感疫苗国外医学预防诊断治疗用生物制品分册国家药典委员会中华人民共和国药典三部曾光流感大流行与应对策略期刊论文，吸附适宜时间后，补加维持液，置培养天，收获细胞培养物检测其血凝效价。

结果见表。

表流感病毒的接种量研究方法及结果毒种稀释度不同亚型流感病毒结果由表可见，将流感病毒按稀释后接种单层细胞，可获取最高的血凝效价。

流感病毒最佳收获时间研究材料流感病毒。

细胞细胞。

其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺生理盐水液主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜超低温冰柜家用冰箱刻度吸管血凝板加液槽漩涡振荡器细胞培养瓶方法取流感毒种，按定比例稀释后接种细胞，置培养不同时间，每天抽样后进行检测。

结果见表。

表不同收获时间的流感病毒试验研究结果培养时间不同亚型流感病毒结果由表可以看出，甲，甲病毒置培养天型病毒培养天时流感病毒血凝效价达到最高。

流感病毒不同培养温度的研究材料流感病毒细胞细胞。

其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺生理盐水液主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜不同培养温度对流感病毒的影响材料流感病毒。

细胞细胞。

其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺生理盐水液主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜超低温冰柜家用冰箱刻度吸管血凝板加液槽漩涡振荡器细胞培养瓶方法取流感毒种，按定比例稀释后接种细胞，置不同温度培养，三天后收获培养液，用直接血凝法测定其血凝效价，详见表表不同温度培养流感病毒的试验研究结果不同亚型流感病毒培养温度结果由表可见，是流感病毒于细胞内繁殖的最佳温度。

第三章流感病毒在细胞细胞内的遗传稳定性研究材料流感病毒。

细胞细胞。

其他培养基小牛血清胰蛋白酶新霉素谷氨酰胺日胚龄鸡胚霍乱滤液生理盐水液硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基营养琼脂培养基支原菌半流体培养基主要仪器台式离心机，倒置显微镜细胞操净台苏州净化二氧化碳培养箱恒温培养箱上海实验仪器厂有限公司恒温水浴箱微量移液器低温冰柜超低温冰柜家用冰箱孵化箱钻孔器检卵器刻度吸管血凝板加液槽漩涡振荡器细胞培养瓶注射器制备方法鸡胚尿囊腔内传代原始毒株启封，以适宜病毒浓度接种日龄鸡胚，置培育小时，剔除死胚，收获尿囊液。

将收获的病毒液以无菌方法合并，按不同分装规格进行分装。

抽取检定用样品后，置以下冻存。

细胞内传代病毒接种及培养仔细挑选生长状态好无污染的单层细胞，弃旧培养液，细胞面用液，轻轻洗涤，至少次。

选择适当稀释度的流感病毒液接种后，置吸附适宜时间。

补加维持液后，置明是禽流感，与当前全球流行的病毒有相似性，世界各国正严阵以待，预防全球流感大流行。

因此流感疫苗的预防接种仍是当今防止流感发生和流行的最有效的手段之。

年鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产疫苗成为可能，采用鸡胚培养技术生产流感灭活疫苗已经