分结晶紫乙醇草酸铵水溶液制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液成分碘碘化钾蒸馏水制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至。沙黄复染液成分沙黄乙醇蒸馏水制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染,水洗。滴加革兰氏碘液,作和体液。甲壳类取整个动物或其中心部分包括肠和鳃。如为带壳贝类或硬壳甲壳类,则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分,然后无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。以无菌操作取经上述处理后的样品不少于,用旋转刀片式均质器均质,或用拍击式均质器均质后,取样品匀浆液置于均质袋中,加入增菌液,充分混匀制备成的样品匀液。如无均质器,则将样品放入无菌乳钵中充分研磨,取磨碎后的样品转入无菌锥形瓶中,加入增菌液,充分振荡混匀,制备成的样品匀液。增菌将制备的样品匀液于培养。初筛实验环境条件和过程控制应参照实验室质量控制基因分型生物型和血清型检测对照设置每次反应使用含有目的基因的创伤弧菌标准菌株作为阳性对照,同时,使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照,以灭菌去离子水类志贺邻单胞菌注表示阳性,表示阴性,表示可变鉴定本部分试验可替代用于创伤弧菌的快速鉴定。模板的制备从中氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落,转至无菌超纯水中,充分混匀后制成肉眼可见的混浊菌悬液,煮沸离心,取上清液用于分析。若不能及时分析则于保存备用。也可以用商业化的提取试剂盒按其说明提取制备模板。扩增和电泳同和。结果判定质控系统阴性对照和空白对照均未出现扩增条带,阳性对照出现预期大小的扩增条带,则检测系统正常。否则,任种对照食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 征求意见稿热煮沸至完全溶解后,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,冷却至备用。溶液成分纤维糖多黏菌素多黏菌素蒸馏水制法将纤维糖溶于蒸馏水中,轻微加热至完全溶解,冷却后加入抗菌素,用微孔滤膜过滤除菌后备用。将溶液与溶液混合后倾注平板。氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂成分胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,高压灭菌。磷酸盐缓冲液成分磷酸氢钾蒸馏水制法贮存液称取的磷酸氢钾溶于蒸馏水中,用氢氧化钠溶液约调节至,用蒸馏水稀释至少于,用旋转刀片式均质器均质,或用拍击式均质器均质后,取样品匀浆液置于均质袋中,加入增菌液,充分混匀制备成的样品匀液。如无均质器,则将样品放入无菌乳钵中充分研磨,取磨碎后的样品转入无菌锥形瓶中,加入增菌液,充分振荡混匀,制备成的样品匀液。增菌将制备的样品匀液于培养。表创伤弧菌生化特性试验项目结果革兰氏染色镜检阴性,无芽胞氧化酶动力纤维糖蔗糖葡萄糖分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶注阳性阴性。表创伤弧菌主要生化特性与其他弧菌的比较鉴别名称氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶︱蔗镜检。邻硝基酚半乳糖苷试剂成分邻硝基酚半乳糖苷蒸馏水缓冲液制法将在的蒸馏水中充分溶解后,加入缓冲液,混匀后置冰箱保存,试验前,将所需用量的溶液加热至后使用。试剂成分甲液萘酚无水乙醇乙液氢氧化钾蒸馏水制法甲液将萘酚于无水乙醇中溶解。乙液将氢氧化钾于适量蒸馏水中充分溶解后定容至。将制备的甲液和乙液分别保存于冰箱改良纤维糖多粘菌素多粘菌素琼脂培养基溶液成分蛋白胨牛肉粉氯化钠溴麝香草酚蓝甲酚红琼脂蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,根据以下公式电泳槽正负极的距离计算并设置电压,使用缓冲液恒压电泳,根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间,使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。也可采用毛细管电泳仪进行扩增产物的检测。结果判定质控系统阴性对照和空白对照均未出现扩增条带,阳性对照出现预期大小的扩增条带,则检测系统正常。否则,任种对照如果出现非上述正常结果,应重做实验,同时排除污染因素。阳性结果在质控系统正常的情况下,待测样品出现预期大小的扩增条带,判定结果为阳性。食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 征求意见稿。试剂见附录中。细菌提取试剂盒。生化鉴定试剂盒。反应配质量控制规范食品分子生物学检测规定执行,下同。模板的制备吸取增菌液于管中,离心,弃去上清液。向沉淀中加入将其悬浮并充分清洗后,离心,弃去上清液,按此步骤反复清洗沉淀次,弃去最后遍上清液,加入无菌超纯水,煮沸,继而离心,上清液用于分析。若不能及时分析则于保存备用。也可以用商品化的提取试剂盒按其说明书要求提取制备模板。扩增引物信息见表。表创伤弧菌检测用引物信息引物序列扩增片段长度对照设置每次反应试剂。琼脂糖凝胶电泳配套试剂。具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。检验程序创伤弧菌检验程序见图。,阳性者操作步骤样品制备新鲜样品采集后应于内完成检验,若不能立即检验,则将样品置于冰箱因创伤弧菌在条件下极易形成活而不可培养的状态,因此样品勿放保存,并尽可能在内完成检验冷冻样品应在不超过的温热条件下解冻不超过。取样鱼类和头足类取其表面组织肠和鳃,贝类则取全部内容物包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物或其中心部分包括肠和鳃。如为带壳贝类或硬壳甲壳类,则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分,然后无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。以无菌操作取经上述处理后的样品不氯化钠溶液成分氯化钠蒸馏水制法将上述氯化钠溶于蒸馏水中,高压灭菌。氧化酶试剂成分,甲基对苯胺盐酸盐蒸馏水制法氧化酶试剂应少量配制,配置后于冰箱内避光保存,并在之内使用完毕。革兰氏染色液结晶紫染色液成分结晶紫乙醇草酸铵水溶液制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液成分碘碘化钾蒸馏水制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至。沙黄复染液成分沙黄乙醇蒸馏水制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染,水洗。滴加革兰氏碘液,作蒸馏水稀释至,分装于适宜容器中,高压灭菌。氯化钠糖铁琼脂斜面成分蛋白胨胰蛋白胨牛肉粉酵母粉氯化钠乳糖蔗糖葡萄糖硫酸亚铁酚红硫代硫酸钠琼脂蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至。高压灭菌后分装于试管中,制成斜面长深度的高层斜面备用。嗜盐性试验培养基成分胰蛋白胨氯化钠按浓度不同依次加入相应量蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至后,分装到角瓶中,每瓶,共配置瓶,分别加入不同量的中,每瓶,共配置瓶,分别加入不同量的氯化钠。继而将各个浓度氯化钠溶液分装至适当容量的试管中,每管,高压灭菌备用。氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基成分蛋白胨酵母粉葡萄糖溴甲酚紫赖氨酸氯化钠蒸馏水制法将中除赖氨酸以外的其他成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,再加入赖氨酸,使其最终浓度达对照培养基不加赖氨酸,分装小试管,每管,高压灭菌。氯化钠培养基成分多价蛋白胨葡萄糖磷酸氢钾氯化钠蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节︱纤维糖乳糖阿拉伯糖︱甘露糖︱甘露醇嗜盐性试验含量创伤弧菌副溶血性弧菌溶藻弧菌霍乱弧菌拟态弧菌河弧菌弗氏弧菌梅氏弧菌嗜水气单胞菌试剂。琼脂糖凝胶电泳配套试剂。具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。检验程序创伤弧菌检验程序见图。,阳性者操作步骤样品制备新鲜样品采集后应于内完成检验,若不能立即检验,则将样品置于冰箱因创伤弧菌在条件下极易形成活而不可培养的状态,因此样品勿放保存,并尽可能在内完成检验冷冻样品应在不超过的温热条件下解冻不超过。取样鱼类和头足类取其表面组织肠和鳃,贝类则取全部内容物包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物或其中心部分包括肠和鳃。如为带壳贝类或硬壳甲壳类,则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分,然后无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。以无菌操作取经上述处理后的样品不热煮沸至完全溶解后,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,冷却至备用。溶液成分纤维糖多黏菌素多黏菌素蒸馏水制法将纤维糖溶于蒸馏水中,轻微加热至完全溶解,冷却后加入抗菌素,用微孔滤膜过滤除菌后备用。将溶液与溶液混合后倾注平板。氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂成分胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,高压灭菌。磷酸盐缓冲液成分磷酸氢钾蒸馏水制法贮存液称取的磷酸氢钾溶于蒸馏水中,用氢氧化钠溶液约调节至,用蒸馏水稀释至分,甲基对苯胺盐酸盐蒸馏水制法氧化酶试剂应少量配制,配置后于冰箱内避光保存,并在之内使用完毕。革兰氏染色液结晶紫染色液成分结晶紫乙醇草酸铵水溶液制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液成分碘碘化钾蒸馏水制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至。沙黄复染液成分沙黄乙醇蒸馏水制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染,水洗。滴加革兰氏碘液,作用,水洗。滴加乙醇脱色,约,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。滴加复染液,复染。水洗待干食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 征求意见稿化钠。继而将各个浓度氯化钠溶液分装至适当容量的试管中,每管,高压灭菌备用。氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基成分蛋白胨酵母粉葡萄糖溴甲酚紫赖氨酸氯化钠蒸馏水制法将中除赖氨酸以外的其他成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至,再加入赖氨酸,使其最终浓度达对照培养基不加赖氨酸,分装小试管,每管,高压灭菌。氯化钠培养基成分多价蛋白胨葡萄糖磷酸氢钾氯化钠蒸馏水制法将中的各种成分溶于蒸馏水中,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节,