表序列此处碱基为，但氨基酸序列完全致，栽培大豆及杂交后代中碱基序列与发表序列完全致。图从大豆中直接克隆全长片段全长片段连入载体后菌落检测，，表达载体的构建用和双酶切克隆载体简称和表达载体简称质粒图，用琼脂糖凝胶电泳检测并回收酶切产物，连接每度过夜连接，构建表达载体图，将插入表达载体，获得携带的原核表达载体，经及酶切鉴定图，图正确。图重组质粒酶切电泳鉴定酶切电泳图泳道酶切，泳道，图和中基因全长序列与比对图谱图质粒检测，泳道泳道对照泳道泳道，双酶切连接图表达载体的构建图质粒酶切验证电泳图，泳道泳道双酶切和转化洋葱表皮细胞及荧光观察挑取分别含有和的大肠杆菌单菌落摇菌过夜，提取质粒，用事先准备好的金粉包裹质粒，将包裹好的质粒用基因枪轰击洋葱表皮，轰击后的洋葱表皮在培养机培养小时后荧光显微镜观察图。可以发现转入载体的洋葱表皮细胞，绿色荧光布满整个细胞，而插入基因的载体转化后的洋葱表皮细胞，可观察到中央大液泡占据了细胞大部分体积，液泡周围有强烈的荧光信号，细胞内的其它位置无明显荧光信号。图中的液泡由三个小液泡组成，液泡之间的膜结构清晰可见，我们判断逆向转运蛋白定位于液泡膜上，这与的研究结果致。基因的原核表达全长克隆利用试剂盒提取大豆总，反转录成，用特异引物和扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与预期片断大小致，为图。分别将叶片中扩增出的连接载体，并进行菌液图及测序鉴定。图洋葱表皮荧光瞬时表达观察的瞬时表达的瞬时表达图大豆中基因全长电泳图泳道基因全长泳道表达载体的构建用和双酶切和载体图，图，回收酶切产物，构建表达载体图，将插入表达载体，获得携带的原核表达载体，经及酶切鉴定图正确。图酶切泳道泳道，图酶切鉴定泳道泳道图全长片段连入载体后菌落检测泳道基因全长泳道图酶切泳道，泳道酶切，图原核表达载体的构建双酶切连接诱导表达将含有质粒的阳性克隆宿主菌经过夜培养。含有的菌株经的诱导，培养，取菌液离心收集菌体，提取细菌总蛋白上清液，经电泳图，在约处发现目的条带，而对照菌体没有，说明质粒成功在中正确表达出融合蛋白。讨论近年来研究表明，逆向转运蛋白在植物抗盐适应机制中起非常重要作用。植物逆向转运蛋白主要分为两种，种是以为代表的基因家族，这类基因表达的蛋白定位于质膜上，主要作用是将排除细胞，从而降低细胞内水平，维持植物的正常生理活动。另种是为代表的液泡膜逆向转运蛋白，这类主要是通过将区隔化到液泡内，从而维持细胞内离子平衡，保证细胞正常代谢活动进行。对克隆到的不同物种来源的逆向运转蛋白基因进行同源比较图质粒在中表达泳道和诱导和泳道和诱导和分析发现，液泡膜型逆向转运蛋白基因间具有高度同源性，质膜型逆向转运蛋白基因间也具有高度同源性，但质膜型和液泡型之间的同源性则较低，表明液泡型与质膜型的亲缘关系较远。植物液泡膜逆向转运蛋白对盐胁迫的表达特性也不相同，有的植物盐胁迫后表达量上升，但在根茎叶中表达丰度不同，有的植物诱导前后表达量不变，有的植物只有在盐胁迫下该蛋白才具有表达特性。半定量是目前研究基因转录水平的有效手段，并可进行定量分析，与传统的杂交相比较，具有特异性高操作简便可靠性强等优点。目前该技术已成功应用于检测多种基因的相对表达量汪以真等，胡廷章等，。本研究使用半定量方法检测供试大豆材料根和叶中逆向转运蛋白基因在胁迫下水平上表达差异，结果表明，该基因在大豆中既有材料本身表达差异，也有盐胁迫后表达差异。即处理前，对盐敏感的栽培大豆叶和根中基因均有较高表达量，尤其是叶中更为显著。而耐盐性较强的野生大豆和杂交后代表达量均很低。在诱导后，和叶和根中基因的表达量均有显著增加，叶和根中基因的表达量也有所上升，但上升幅度没有和明显。根据已发表栽培大豆基因设计引物，我们在供试大豆材料中扩增基因全长，序列相似性比对发现，野生大豆中第个碱基为，栽培大豆和杂交后代株系中该处碱基与发表序列致，均为，但该处碱基差异并未造成氨基酸序列的差异。可以认为该基因在供试的大豆材料间的碱基基本无差异。蛋白质在细胞器中的定位对于阐明其功能具有重要意义。当外界离子浓度提高时，液泡膜和质子泵被激活，将转运到液泡中，减少细胞质中的浓度。在盐胁迫下，冰叶日中花的酶活性增加倍，的反向运输系统的活性增强，过多的盐分被转运到液泡中李辉等，。液泡膜上逆向转运蛋白依赖于液泡膜上或质子泵来提供质子驱动力，进行和的跨膜共转运，从而达到把区隔化于液泡内的功能，方面使细胞渗透压保持定梯度，让水分进入细胞另方面维持细胞质中正常的盐浓度，避免高浓度盐对胞质的伤害，保持生物酶的活性，从而保证细胞的正常代谢活动。本文采用基因枪转化法将基因转入洋葱表皮细胞，观察该基因的亚细胞表达位点，结果在洋葱表皮细胞中央大液泡的周围观察到明显的荧光信号，可以判断该蛋白为液泡膜蛋白。盐胁迫下供试大豆材料中基因表达量的不同可能与其液泡膜质子泵和被激活程度相关，进而调控大豆的耐盐性。这有待今后进步的深入研究。基因的功能最终是通过蛋白质来行使，因此研究盐胁迫下大豆逆向转运蛋白的变化，对分析基因的功能有重要的意义。本文将基因插入原核表达载体的和酶切位点之间，构建原核表达载体。将该载体转化到大肠杆菌中，基因在大肠杆菌中得以高效表达。这为今后对逆向转运蛋白的抗体制备及大豆植株中该蛋白表达的分析奠定了良好的基础。不过，本文对基因功能的研究还是处于初步阶段，尚需借助基因过表达或基因沉默等技术，比较和分析转基因植株基因沉默后植株与正常植株的耐盐性差异，从而深入阐明该基因与不同大豆材料耐盐性的具体关系。全文结论与栽培大豆品种相比，盐胁迫下滩涂野大豆种群和及它们的杂交后代代株系尤其是前者植株含量降幅和增幅圴较小，但吸收的在根中积累较多，而向叶片运输较少。和中均扩增出条为约的耐盐基因分子标记带，条为约的盐敏感基因分子标记带，而中仅扩增出条约的盐敏感基因分子标记带。这与供试大豆材料间的耐盐性差异是致的。在供试大豆材料中扩增全长序列，发现它们基本无差异。在盐胁迫过程中，基因在大豆材料叶和根中的表达量均有所升高，升幅是。将该基因插入含有的表达载体中，并转入洋葱表皮细胞，显示该基因表达蛋白定位于液泡膜上。构建基因表达载体，并转入大肠杆菌中，经诱导后电泳，表明该基因在中高效表达。创新性本文结合常规生理指标测定和抗性标记基因方法，在植株整体水平和基因水平对供试的滩涂野大豆和栽培大豆及其杂交后代的耐盐性进行了综合鉴定。耐盐相关基因的研究仅见于栽培大豆中，在野生大豆及其与栽培大豆的杂交后代中尚未见研究，本文首次克隆了滩涂野大豆和栽培大豆及其杂交后代中的基因，并将该基因在大肠杆菌中高效表达，这为该蛋白的抗体制备盐胁迫下大豆植株体内蛋白水平上的分析和深入揭示它与大豆耐，，，，，，，，，，，，，，，，，致谢本研究是在导师於丙军教授的悉心指导下完成的。从课题的选择实验的设计到论文的撰写无不倾注着导师的心血。三年来导师在学习生活方面的指导关心和支持让我度过了愉快而充实的研究生生活导师严谨的科研作风和实事求是的科学精神使学生受益匪浅。在此论文完成之际，谨向辛勤培育我的於老师致以崇高的敬意和诚挚的感谢,同时要衷心感谢植物学科老师为实验的完成提供了必备的实验平台以及技术上的支持和帮助。特别感谢中国农业科学院邱丽娟研究员和我的好友武健东博士为实验的顺利完成提供了不可缺少的热情帮助。感谢植物逆境生物实验室温暖大家庭的兄弟姐妹伍应保张新梅周强张晓可杜莉莉曹金花陈光武玉妹李发院胡振民等在学习和实验中给予的大力支持和鼓励。同时，我的朋友刘霁徐晓安杨永庆张欢曹春燕胡元兵栗海俊等在三年的学习和生活中提供的帮助，他们为我的研究生生活带来了很多欢乐，也让我的生活更加充实，在此表示最诚挚的感谢,衷心地感谢我的父母和家人，是他们多年始终如的关怀鼓励和无私的爱使我得以集中精力完成学业，它们是我坚强的后盾和精神支柱。在此，向他们表示真诚的感谢和深深地祝福,周其好江苏南京二年四月性间的具体关系奠定了良好的基础。存在问题与展望基因作用的最终功能物质是蛋白质。本研究着重从基因水平上分析了大豆逆向转运蛋白与大豆耐盐性的可能关系，尚需要结合该蛋白在盐处理下的响应情况和功能分析进步揭示其与大豆耐盐性的具体关系。本研究虽对该蛋白做了亚细胞定位分析，显示其定位于液泡膜上。不过盐胁迫下液泡对离子的区隔化是个复杂的过程，若能使用更先进的设备和技术动态观察及测定盐胁迫下液泡内外离子流如的变化，将有助于更能清晰地揭示液泡膜逆向转运蛋白在我们利用滩涂野大豆改良栽培大豆耐盐性过程中的作用机理。参考文献常汝镇，陈舞，邵桂花，万超文盐对大豆农艺性状及籽粒品种的影响大豆科学陈宣钦，刘怀攀，罗庆云耐盐性不同的野大豆种子和幼苗对等渗水分和胁迫的响应南京农业大学学报付光明，苏乔，吴畏，赵洪海，安利华转基因玉米的获