学生物学研究所分子生物室保存轮状病毒毒株为型野生型毒株，由医学生物学研究所分子生物室从云南省昭通市名婴幼儿的粪便中分离培养得到，代次为工厂和生物反应器微载体培养轮状病毒，。细胞工厂将细胞连续浸没在无通气的浅培养基中，无任何搅动，病毒滴度较低而微载体技术虽然通过培养基的连续搅拌实现营养物质和氧气的交换，但这种搅拌对细胞产生定的剪切应力，会引起细胞死亡，导致病毒产量降低。因此，开发新型轮状病毒培养方式已成为种趋势。生物反应器是款高密度细胞轮状病毒在潮汐式生物反应器培养的工艺探究病毒学论文和生长的表面积。本研究首次采用潮汐式生物反应器培养轮状病毒，以期为轮状病毒疫苗的研发奠定定的基础。轮状病毒在潮汐式生物反应器培养的工艺探究病毒学论文。葡萄糖含量的测定每天取培养液，用葡萄糖检测仪检测培养基中葡萄糖含量，若葡萄糖含量低于时，弃去旧培养液，更换密度低，贴壁不均，耗费大量人力和空间，难以规模化生产。后来又采用细胞工厂和生物反应器微载体培养轮状病毒，。细胞工厂将细胞连续浸没在无通气的浅培养基中，无任何搅动，病毒滴度较低而微载体技术虽然通过培养基的连续搅拌实现营养物质和氧气的交换，但这种搅拌对细胞产生定的剪切应力，会引起细胞死亡，导致病毒产量降低。因此，开发新型轮状病毒细胞代由医学生物学研究所分子生物室保存轮状病毒毒株为型野生型毒株，由医学生物学研究所分子生物室从云南省昭通市名婴幼儿的粪便中分离培养得到，代次为。主要试剂及仪器培养基由医学生物学研究所提供新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司激活用胰酶购自美国公司标记的兔抗山羊购自美国病毒的电镜观察将轮状病毒按接种于细胞，按照项方法培养，取病毒收获液，负染后经透射电镜观察。病毒最佳接种的确定将轮状病毒分别按接种于细胞，按照项方法培养，每天取样，共。采用蚀斑法检测病毒滴度将生长状态良好的细胞接种于孔板中，臵，培养箱内培养，待细胞长成致密单层，将经胰酶激活的待测样品倍稀释后，说明书提取病毒基因组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色检测病毒基因组核酸带型。病毒增殖的检测采用免疫荧光法。将轮状病毒按接种于细胞，按照项方法培养，每天取样，共。将细胞接种于孔板中，臵，培养箱内培养待细胞长成致密单层，取经胰酶激活的轮状病毒培养上达，个的培养瓶相当于的病毒颗粒，而个转瓶的病毒产量只能达到的病毒颗粒，因此，个的培养瓶培养轮状病毒的产量相当于约个转瓶，这样高滴度的病毒有利于简化轮状病毒疫苗后续的生产工艺。综上所述，本实验初步建立了潮汐式生物反应器培养轮状病毒的工艺，为进步后，病毒收获液的滴度最高，达。见图。因此确定轮状病毒在细胞上的最佳接种为，最佳培养时间为。图接种不同轮状病毒的增殖曲线讨论规模化培养病毒在疫苗生产过程中极其重要。目前主要采用转瓶工艺生产轮状病毒。潮汐式生物反应器培养轮状病毒的原理与转瓶系统非常相似，均是交替地将细胞暴露∶稀释，孵育再加入标记的兔抗山羊∶稀释，孵育，同时设阴性细胞对照。荧光显微镜下观察病毒增殖情况。图轮状病毒基因组核酸带型病毒增殖的检测荧光显微镜下观察显示，轮状病毒感染细胞后可观察到病毒的增殖随着感染时间的延长，轮状病毒荧光阳性的细胞数目增加感染后，阳性细胞数目最多感染后，阳轮状病毒在潮汐式生物反应器培养的工艺探究病毒学论文清接种于细胞，臵，培养箱中培养过夜将细胞用多聚甲醛和甲醇固定后，加入毒株免疫山羊获得的多克隆血清本实验室制备，∶稀释，孵育再加入标记的兔抗山羊∶稀释，孵育，同时设阴性细胞对照。荧光显微镜下观察病毒增殖情况。轮状病毒在潮汐式生物反应器培养的工艺探究病毒学论文田宇婧，周建民，等采用潮汐式生物反应器进行细胞培养的研究中国农学通报，尹娜，周艳，刘洋，胡晓青，张光明，孙茂盛，李鸿钧潮汐式生物反应器培养轮状病毒工艺的建立中国生物制品学杂志，。病毒基因组核酸带型检测将轮状病毒按接种于细胞，按照项方法培养，每天取样，共。参照孔细胞对照，确定用生物反应器培养轮状病毒的最适。病毒基因组核酸带型检测将轮状病毒按接种于细胞，按照项方法培养，每天取样，共。参照说明书提取病毒基因组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色检测病毒基因组核酸带型。病大规模生产轮状病毒灭活疫苗奠定了基础。参考文献安红，张海红，王名强，等细胞工厂培养轮状病毒基因重配株型条件的优化研究微生物学免疫学进展，张永欣，刘馨，张光明，等细胞微载体技术规模化培养轮状病毒中国生物制品学杂志，范秀娟，孙燕，孙振鹏，等生物反应器培养轮状病毒基因重配株条件的优化微生物学免疫学进展，马良，于空气与营养物质中。但潮汐式生物反应器克服了转瓶系统的很多缺点个的培养瓶可替代约个的转瓶，减少了人力和空间的占用比转瓶系统操作相对简单，降低了污染的概率采用潮汐式原理，增强了细胞和病毒对营养物质的利用，降低了培养基如血清等的消耗，大大降低了生产成本使用生产轮状病毒滴度可性细胞数目逐渐减少。见图。图轮状病毒感染细胞后不同时间的免疫荧光分析病毒的电镜观察轮状病毒感染细胞后，电镜观察可见大小约，形态结构完整的轮状病毒颗粒，见图。图轮状病毒的电镜观察病毒最佳接种的确定以不同轮状病毒感染细胞后，病毒增殖达高峰，随后逐渐下降。其中，以病毒感染细胞毒增殖的检测采用免疫荧光法。将轮状病毒按接种于细胞，按照项方法培养，每天取样，共。将细胞接种于孔板中，臵，培养箱内培养待细胞长成致密单层，取经胰酶激活的轮状病毒培养上清接种于细胞，臵，培养箱中培养过夜将细胞用多聚甲醛和甲醇固定后，加入毒株免疫山羊获得的多克隆血清本实验室制备，轮状病毒在潮汐式生物反应器培养的工艺探究病毒学论文度将生长状态良好的细胞接种于孔板中，臵，培养箱内培养，待细胞长成致密单层，将经胰酶激活的待测样品倍稀释后，接种于孔板细胞上，吸附每孔加入含琼脂糖的维持液，倒臵于，培养箱中培养每孔加入含琼脂糖和中性红的维持液，倒臵于，培养箱中继续培养，观察蚀斑形成，并按下式计算病毒滴度，同时设。主要试剂及仪器培养基由医学生物学研究所提供新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司激活用胰酶购自美国公司标记的兔抗山羊购自美国公司病毒提取试剂盒购自美国公司细胞裂解液生物反应器和葡培养的台式生物反应器，其通过培养基和空气的潮汐式运动，增强细胞和病毒对营养物质的利用。生物反应器中含有载体，其为种聚对苯甲酸乙醇酯，纤维培养基质，这种纤维状的载体大大提高了细胞附着和生长的表面积。本研究首次采用潮汐式生物反应器新的生长液。细胞培养过程中活细胞计数每天取载体片，装入离心管中，加入细胞裂解液，振荡，水浴放臵，取出振荡，再次于水浴放臵，经适量稀释后，加入细胞计数板进行活细胞计数。轮状病毒疫苗生产早期采用转瓶培养工艺。该工艺细胞生长密度低，贴壁不均，耗费大量人力和空间，难以规模化生产。后来又采用细胞培养方式已成为种趋势。生物反应器是款高密度细胞培养的台式生物反应器，其通过培养基和空气的潮汐式运动，增强细胞和病毒对营养物质的利用。生物反应器中含有载体，其为种聚对苯甲酸乙醇酯，纤维培养基质，这种纤维状的载体大大提高了细胞附着公司病毒提取试剂盒购自美国公司细胞裂解液生物反应器和葡萄糖检测仪均购自公司低熔点琼脂糖购自美国公司中性红购自美国公司。轮状病毒疫苗生产早期采用转瓶培养工艺。该工艺细胞生长，接种于孔板细胞上，吸附每孔加入含琼脂糖的维持液，倒臵于，培养箱中培养每孔加入含琼脂糖和中性红的维持液，倒臵于，培养箱中继续培养，观察蚀斑形成，并按下式计算病毒滴度，同时设孔细胞对照，确定用生物反应器培养轮状病毒的最适。材料与方法细胞及毒株细胞代和