基中含量分别为和的背角，依次为和，并设臵对照组理论浓度为，以上每个组别均设个重复孔依据等的研究方法，对鳃细胞进行的暴露孔细胞培养板用于检测细胞活力，孔细胞培养板上清用于检测对较为敏感的及含量贾睿等，毒性效应指标测定严格按照试剂盒操作说明，分别测定孔细胞培养板中鳃细胞的细胞活力，以及孔细胞培养板中鳃细胞上清液的及含量统计分析所得数据运用统计软件分析采用概率单位分析计算采用培养方法并进步探索和改进将洗净的背角无齿蚌暂养于抗生素溶液中进行初步消毒，然后用酒精冲洗蚌并自然晾干无菌操作解剖出鳃，用缓冲液清洗后，剪成小块鉴于细胞分解方法如应用较为广泛的胰蛋白酶在分解靳雨丽贾睿等链霉蛋白酶在分解，和细胞培养基的血清浓度如通常加入的含量为，或贾睿等张念伟等，是决定细胞培养成败的关键因素谭凤霞等贾睿等，因此，分别用上述两种细胞分解方法分解鳃小块，进而用上述两种含量的培养探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养途径环境生物学论文用如果能在已有的个体水平淡水贝类观察体系的基础上，突破该蚌鳃细胞培养的瓶颈，开拓极具上述潜力和优势的细胞水平污染物毒性评价技术，对完善上述观察体系而言无疑具有明显的必要性和应用价值针对上述问题，本研究拟先围绕背角无齿蚌鳃细胞原代培养及确保细胞存活率的方法进行探索，并取得突破在此基础上，基于该细胞来实际探究和评价的细胞水平毒性效应，以期方面突破淡水贝类鳃细胞存活率低存活时间短的瓶颈难题，另方面从细胞毒性效应的新角度为基于背角无齿蚌生物监测的水体污染评价应用提供进步的理论支撑材料与方法实验材料背角无齿，背角无齿蚌作为淡水贝类观察研究体系我国淡水生态环境污染评价应用最为广泛的生物监测体系之的专用指示生物邢慧芳等，其鳃是积累和毒性作用的关键靶器官陈修报等，然而，背角无齿蚌鳃细胞尚无培养成功的先例值得注意的是，迄今贝类的相关研究认为，离体后首次培养生物性状尚未发生明显变化基本保持原组织特性的原代培养鳃细胞，非常适合建立较灵敏评价等污染物毒性的研究模型，有着活体动物无法比拟的优点，特别是污染物与细胞直接作用，反应速度快，毒理学检测周期短大大减培养毒性效应环境生物学背角无齿蚌镉鳃细胞引言镉是全球重点防控污染物，在联合国环境规划署提出的种危害全球环境的化学物清单中，位居首位，同时，也被国际癌症研究机构和世界卫生组织列为类致癌物和第位优先研究的食品污染物，我国淡水生态环境中污染形势仍较为严峻蓝郁等，中国生态环境状况公报即指出淡水水体存在超标现象水体受到污染能够导致水生生物的器官生物学参数行为生长率和血液发生损伤，并且会通过食物链传递摘要为了探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养途径，并阐释其在评价水体毒性效应上的潜力，本研究比较了不同酶分解方法链霉蛋白酶胰蛋白酶的鳃细胞存活率差异，并分析了培养基中不同血清浓度对鳃细胞存活率的影响，细胞臵于生化培养箱中培养进而根据对鳃细胞的值设定和个理论浓度梯度，对原代培养的鳃细胞进行暴露，分析了细胞活力总超氧化物歧化酶过氧化氢酶和酸性磷酸酶的变化特征结果表明链霉蛋白酶在分解的鳃细胞存活率为，显著高于胰蛋白酶在分解科学学报，贾睿，曹丽萍，丁炜东，等华北农学报，贾睿，曹丽萍，杜金梁，等细胞损伤的保护和抗氧化作用中国水产科学，靳雨丽上海上海海洋大学蓝郁，梁荣昌，赵学敏，等铊环境污染事件及应急处臵对贺江生态风险的影响环境科学学报，李勇，孟立霞凯里学院学报，刘国安，杨燕，关泉林，等西北师范大学学报自然科学版，刘涛，郭辰，赵晓红生命科学，罗桂芬，文旭辉，杨公社，等细胞与分子免疫学杂志，马陶武，王子健，易浪波的敏感性比较环境科学学报，谭凤霞，杨方星，王卫民，等型的探讨水生生物学报，万小琼，吴和过氧化氢，保护细胞免受或减少的氧化损伤，在机体的氧化与抗氧化平衡中起着至关重要的作用，暴露猪肾细胞后，亦引起含量增加杨佳等，与本研究结果致的主要作用是促使分解成和，从而免于或降低对细胞氧化损伤，等报道的暴露斑马贻贝鳃细胞并未引起含量明显增加，而浓度达到时含量显著增加至对照组的近倍虽然本研究的变化的最终结果与等研究相似，但是随着浓度增加呈现出明显的诱，其平均含量仍是对照组的倍表表背角无齿蚌原代培养鳃细胞对的毒性效应注同行中，不同字母表示差异显著水体中能通过细胞钙离子通道和价金属离子转运蛋白透过细胞膜而进入细胞内，从而诱导产生大量的活性氧，当过量的无法被及时清除时就会对细胞造成氧化损伤影响细胞活力杨佳等，产生量与浓度总体呈正相关，因此，导致背角无齿蚌鳃细胞活力与浓度之间呈显著的线性负相关含量为图这可能是由于较高浓度中的脂质成分引起细胞膜组成的改变或脂质堆积，从而导致细胞活力存活率降低造成的根据上述研究结果，收集链霉蛋白酶在分解的背角无齿蚌鳃细胞，用含量的培养基进行原代培养，虽然细胞存活率与培养时间之间呈线性负相关，与角帆蚌外套膜细胞靳雨丽，斑马贻贝，及淡水珠蚌，鳃细胞原代培养的变化趋势致，但是其维持细胞存活率优良状态的时间达到了图，明显高于其它淡水贝类如斑马贻贝探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养途径环境生物学论文文忠，贺纪正中国环境科学，邢慧芳，李涌泉，杨慧珍，等无齿蚌外套膜和鳃抗氧化酶活性及脂质过氧化的影响环境科学学报，杨佳，董峰，李向阳，等细胞活性氧和抗氧化酶活性的影响生物技术通讯，张念伟，刘肖峰，王娜，等农业生物技术学报，陈修报，郑浩然，王洋，刘洪波，杨健基于原代培养背角无齿蚌鳃细胞的镉毒性效应评价环境科学学报，基金中国水产科学研究院基本科研业务费中国水产科学研究院淡水渔业研究中心基本科研业务费国家自然科学基金江苏省自然科学基金探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养途径环境生物学论文了溶酶体合成结论本研究首次探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养，初步建立了较为适宜的培养方法，并获得了培养时间长达，存活率的鳃细胞，突破了淡水贝类鳃细胞存活率低存活时间短的瓶颈，同时为利用细胞评价水体污染及污染物毒性奠定了必要的基础背角无齿蚌鳃细胞的细胞活力及含量变化有潜力作为评价水环境毒性污染的生物指标在此基础上，今后可尝试背角无齿蚌鳃细胞的传代培养，并进步研究对其毒性机制参考文献陈修报，刘洪波，苏彦平，等标准化背角无齿蚌的急性毒性及脂质过氧化和损伤的影响农业环，然而，在不同物种中其分解细胞的存活率具有明显的差别刘国安等，应用胰蛋白酶分解人胃粘膜上皮细胞的细胞存活率为，高于链霉蛋白酶分解后的细胞存活率刘国安等，用链霉蛋白酶分解猪肌卫星细胞的细胞存活率为，与胰蛋白酶分解后的细胞存活率为没有明显差别罗桂芬等，而本研究发现在背角无齿蚌鳃细胞的分解过程中，链霉蛋白酶在分解的细胞成活率显著高于胰蛋白酶在分解，这在斑马贻贝组织细胞分解中也有相似效果，鉴于链导抑制特征表，提示背角无齿蚌鳃细胞可能较斑马贻贝鳃细胞对毒性更为敏感，在受到较低浓度如暴露时即可激活以应对氧化损伤，而浓度进步增加如则会导致失活是贝类重要的免疫因子，同时也可作为环境应激指标，贝类鳃细胞的溶酶体中含有丰富的，本研究中，经暴露的鳃细胞培养上清液中含量较对照组显著增加表，这与暴露斑马贻贝鳃细胞的含量变化趋势致，可能是由于暴露激活了活力或者诱导表，这与对斑马贻贝鳃细胞的毒性效应相吻合，也与胁迫猪肾细胞引起的毒性效应相致杨佳等，提示细胞活力有潜力应用于水环境污染评价本研究发现暴露的鳃细胞培养上清液中和的平均含量较对照组明显升高表，且和暴露组的含量和暴露组的含量以及所有暴露组的含量均显著高于对照组表这可能是由于鳃细胞受到氧化损伤后，导致细胞膜的通透性增强，从而引起细胞内的和溢出量增加能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧，和淡水珠蚌，鳃细胞维持如此高存活率的培养时间同时，也达到细胞毒理学研究对细胞存活率和存活时间万小琼等，的要求毒性效应鳃细胞活力随着浓度的增加而降低表，两者之间呈显著的线性负相关，回归关系为随着浓度的增加，和含量总体呈增加的趋势，且均在时含量最高表而含量呈现出诱导抑制的变化趋势，其最高含量出现在浓度为的暴露组，平均含量达到对照组的倍且显著高于对照组暴露组含量最低出现在浓度为时，尽管如蛋白酶所需浓度较低可以节省酶的用量，且分解细胞成活率高对细胞的损伤小，因此，链霉蛋白酶在分解适宜用作淡水贝类鳃细胞的分解方法细胞培养基中的含量是影响细胞存活率的又关键因素谭凤霞等贾睿等，相较于含量为的细胞培养基，稀有鮈鲫鳍细胞更适宜在含量为的细胞培养基生长谭凤霞等，而鲫鱼肝细胞贾睿等，和锯齿巴非蛤外套膜细胞，更适宜在含量为的细胞培养基中生长与后者类似，本研究发现无论是以链霉蛋白酶还是胰蛋白酶分解背角无齿蚌鳃细胞，细胞培养基中含量为的细胞存活率均高于探究淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的原代培养途径环境生物学论文齿蚌鳃细胞存活率图背角无齿蚌原代培养鳃细胞的存活率不同字母表示差异显著，图背角无齿蚌原代培养的鳃细胞由于淡水贝类鳃等组织的生理结构功能分化营养需求等方面的特殊性，至今还没有建立起细胞系，原代培养仍然是主要方法李勇等，需要引起重视的是，淡水贝类鳃细胞原代培养至今尚未取得实质性突破维持细胞存活率的优良状态往往难以超过，而本研究是背角无齿蚌鳃细胞原代培养的首次尝试胰蛋白酶和链霉蛋白酶是细胞培养过程中广泛应用的细胞分解酶单因素方差分析对细胞存活率细胞活力及含量进行组间差异性分析应用等级相关系数分析细胞存活率与培养时间细胞活力与浓度之间的相关性，并用回归模型分析变量之间的关系表示差异水平或相关性显著结果与讨论原