电化学沉积羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞的影响（骨科材料论文）

实验方法钛羟基磷灰石支架的制备及表征按课题组前期研究结果制备底面直径高孔径孔隙率为的圆柱体钛支架。

电化学沉积羟基磷灰石涂层将磷酸氢钠溶液和硝酸钙溶液混合，磁力棒搅拌混匀，将部分钛支架清洗后臵于混合溶液中，采用电化学工。

下离心后可见液体分为层，底部的苯酚氯仿层中间层和无色水样上层，在上层水样中，体积占总体积左右。

吸取上层水样至新管中，避免吸到中下层液体。

加入异丙醇，上下颠倒混匀，下离心，充分沉淀，可在管底见白色沉淀。

弃去上清只留沉淀，加入体积分数乙醇，震荡洗涤后下离心，弃去上清，室温下干燥，加入无核酶水溶解，利用测量提取的浓度。

使用试剂盒将获得的反转录为单链，使用带有孔板的仪器进行实时分析。

引物序列见表。

将目标基因的表达水平相对于进行标准化，并利用∆∆方法计算每个目标基因的相对基因表达值。

以上实验重复次，电化学沉积羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞的影响骨科材料论文青霉素链霉素双抗试剂盒同仁骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基茜素红染液赛业生物，中国碱性磷酸酶染色试剂盒染液索莱宝，中国鬼笔环肽西安百莹，中国多聚甲醛，中国。

实验方法钛羟基磷灰石支架的制备及表征按课题组前期研究结果制备底面直径高孔径孔隙率为的圆柱体钛支架。

电化学沉积羟基磷灰石涂层将磷酸氢钠溶液和硝酸钙溶液混合，磁力棒搅拌混匀，将部分钛支架清洗后臵于混合溶液中，采用电化学工作站于室温下进行电化学沉积，沉积后样品经过纯化水清洗并吹干备用等离子喷涂羟基磷灰石涂层采用等离子电弧作为热源，将羟基磷灰石粉末加热到熔融状态，于真空中高速喷向钛支架表面，形成牢固涂层。

无涂层钛支架作对照组消化。

将相应的细胞悬液移到离心管中，常温离心，弃上清液，生长培养基重悬细胞。

取细胞悬液，适当稀释后细胞计数板镜下计数，计算细胞密度。

以的细胞密度种板培养。

接种后的细胞仍放臵于体积分数相对湿度的细胞培养箱内培养。

骨髓间充质干细胞的鉴定将孔的第代骨髓间充质干细胞悬浮液加入孔板中，使用基础培养基培养，每进行换液，待细胞融合度达到时弃掉上清液，轻柔漂洗次，加入成骨诱导培养基，每孔，每换液次，诱导周后视细胞的形态变化及生长状态进行茜素红染色，注意当周后孔板内开始出现钙结节，换液形式改为每次半换液。

同时设臵副孔，使用基础培养基培养骨髓间充质干细胞相同天数后进行茜素红染色。

骨髓间充质干细胞增殖检测首先使用高温高压蒸汽灭菌法对组支架进行消毒灭菌处涂涂层表面存在密集的微小羟基磷灰石颗粒，涂层并不光滑，因此作者认为涂层的完整性连续性是影响骨髓间充质干细胞黏附伸展的重要因素。

既往研究认为支架表面越粗糙更利于细胞的增殖，方面是由于此结构有更多的表面积提供细胞黏附增殖，另方面羟基磷灰石具有润湿性，使得支架的润湿性增加，为支架内的细胞提供更好的营养物质。

但此次实验检测发现，等离子喷涂组，的细胞增殖均多于电化学沉积组。

电化学沉积组涂层表面依然可见部分裸露的钛颗粒，所以羟基磷灰石涂层较等离子喷涂组更薄些，而羟基磷灰石可以促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化，因而等离子喷涂组较厚的涂层可以更好地促进骨髓间充质干细胞的增殖。

等，研究发现细胞在体外培养到定程度，当密度过大后细胞膜表面的糖蛋白便会识别这种信息，使细胞停等发现支架孔径最适宜骨长入。

在小孔径支架中会先形成软骨，再进步矿化，而在大孔径支架中更倾向于直接形成骨组织，因此该实验选用孔径的钛支架。

采用电化学沉积与等离子喷涂技术于打印钛支架表面制备羟基磷灰石涂层，两种涂层的形貌截然不同，电化学沉积组涂层可见羟基磷灰石颗粒聚集形成针棒样结构并逐渐融合形成片板状结构，部分钛颗粒表面没有完全被羟基磷灰石涂层覆盖，涂层较薄，与其他技术相比，采用电化学沉积技术形成的结晶涂层是多孔且更为凹凸不平而等离子喷涂组涂层成表面较为平整连续，几乎不可见钛颗粒结构，可见细小颗粒状球状羟基磷灰石，较电化学沉积组涂层厚度厚。

同时两种涂层均没有改变支架的孔径，各组的孔径与设计误差均小于。

由于打印钛支架不同的孔径参数对细胞的增殖碱性磷酸酶活性电化学沉积组中黑色氧化钴面积偏少，与对照组几乎无黑色氧化钴相比碱性磷酸酶活性有所增强，但逊于等离子喷涂组，见图。

共培养后的茜素红染色显示，等离子喷涂组的矿化结节呈密集趋势，已开始聚集出现团块状结节，结节颜色呈红色，中心区域已呈红褐色电化学沉积组中的矿化结节较小，较分散，颜色相对偏浅对照组中出现少部分浅红色点状分散稀疏的小结节，见图。

为方便统计算统计分析，将对照组中数据进行标准化处理为。

相同时间点下，等离子喷涂组电化学沉积组的骨桥蛋白型胶原蛋白骨钙蛋白表达均高于对照组材料生物相容性由实验增殖与黏附检测结果可知，等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层具有良好的生物相容性。

表各组钛支架上骨髓间充质干细胞的成骨基因表达图等离子喷涂与电化学沉积羟基磷细增殖黏附及成骨分化的影响。

方法采用等离子喷涂与电化学沉积法分别在钛支架表面制备羟基磷灰石涂层，以未涂层的钛支架为对照。

将大鼠骨髓间充质干细胞与种支架共培养，共培养时，采用法检测细胞增殖共培养后，采用扫描电镜与激光共聚焦显微镜观察细胞黏附情况共培养时进行碱性磷酸酶染色，共培养时进行茜素红染色，共培养，时进行实时定量荧光检测，分析骨髓间充质干细胞的成骨分化。

结果与结论随着培养时间的延长，各组细胞增殖率增加，等离子喷涂组细胞增殖率高于电化学沉积组对照组扫描电镜显示，组支架上均可见细胞黏附，其中等离子喷涂组细胞铺展面积最大，对照组细胞铺展面积最小激光共聚焦显微镜显示，等离子喷涂组肌动蛋白纤维最为致密，细胞伸展状态良好电化学沉积组细胞肌动蛋白相对致中的矿化结节较小，较分散，颜色相对偏浅对照组中出现少部分浅红色点状分散稀疏的小结节，见图。

为方便统计算统计分析，将对照组中数据进行标准化处理为。

相同时间点下，等离子喷涂组电化学沉积组的骨桥蛋白型胶原蛋白骨钙蛋白表达均高于对照组材料生物相容性由实验增殖与黏附检测结果可知，等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层具有良好的生物相容性。

表各组钛支架上骨髓间充质干细胞的成骨基因表达图等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层的形貌图骨髓间充质干细胞的鉴定图骨髓间充质干细胞在种钛支架上培养的黏附图骨髓间充质干细胞在种钛支架培养的黏附图各组钛支架诱导骨髓间充质干细胞的早期成骨分化图骨髓间充质干细胞与组钛支架共培养后的矿化结节讨论在组织工程中羟基磷灰石涂层往研究认为支架表面越粗糙更利于细胞的增殖，方面是由于此结构有更多的表面积提供细胞黏附增殖，另方面羟基磷灰石具有润湿性，使得支架的润湿性增加，为支架内的细胞提供更好的营养物质。

但此次实验检测发现，等离子喷涂组，的细胞增殖均多于电化学沉积组。

电化学沉积组涂层表面依然可见部分裸露的钛颗粒，所以羟基磷灰石涂层较等离子喷涂组更薄些，而羟基磷灰石可以促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化，因而等离子喷涂组较厚的涂层可以更好地促进骨髓间充质干细胞的增殖。

等，研究发现细胞在体外培养到定程度，当密度过大后细胞膜表面的糖蛋白便会识别这种信息，使细胞停止增殖生长。

虽然电化学沉积组涂层形貌较为粗糙，但垂直的片状羟基磷灰石涂层及其间隙反而可能导致供细胞生长表面积降低，影响细胞的生长电化学沉积羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞的影响骨科材料论文石涂层的形貌图骨髓间充质干细胞的鉴定图骨髓间充质干细胞在种钛支架上培养的黏附图骨髓间充质干细胞在种钛支架培养的黏附图各组钛支架诱导骨髓间充质干细胞的早期成骨分化图骨髓间充质干细胞与组钛支架共培养后的矿化结节讨论在组织工程中羟基磷灰石涂层的加入增加了钛支架表面的生物活性能，不仅能为骨细胞的黏附生长提供良好的支撑，还可提高钛支架表面的润湿性与骨传导性，而这对细胞的黏附增殖分化及骨界面的早期愈合均有积极作用。

但羟基磷灰石粒径过大会增加种植体表面积，造成离子过多泄露，并难以降解相反，如果羟基磷灰石粒径过小会在吞噬作用后引起细胞毒性，同时羟基磷灰石涂层形貌对重塑骨组织起至关重要的作用，这提示不同工艺制备的羟基磷灰石形貌对骨髓间充质干细胞的增殖分化有不同的影响作用。

电化学沉积是指金属或合金在无机盐生物活性因子等水溶液非水溶液中表面形成涂层的过程，是目前较有前景的组织工程涂层制备工艺之。

该技术沉积的难易程度以及沉积物的形态与沉积物的性质有关，也依赖于电解质的组成值温度电流密度等因素。

引言近年来在骨科植入物方面，增材制造打印制备的植入物实现了与体内骨缺损外形的良好匹配，且其具备的孔隙结构不仅减轻了应力遮挡，并且加速了新骨的长入，因而在骨移植骨融合等骨修复手术中被广泛使用。

打印数字化和快速成型的特点，使其能根据患者的解剖学特点定制个体化植入物，达到相对精确匹配，在医学领域有着广阔的应用前景，。

骨髓间充质干细胞与支架共培养后的成骨分化培养第天的碱性