1、配对检验，为差异有显著性意义。结果人新鲜羊膜与脱细胞羊膜组织学观察结果采用苏木精伊红染色人新鲜羊膜，倒臵相差显微镜下可见人新鲜羊膜中大量上皮细胞呈现串珠状排列于羊膜基底膜表面，其细胞形态呈现圆形或者类圆形，核深染色呈紫色上层深面基底膜结构完整，呈现为深粉色皮下结缔组织疏松并可见少量人羊膜间充质干细胞分布其中，细胞核深染呈紫色，见图。经过酶消化后羊膜表面及基底层细胞已经全部被移除，层来源间充质干细胞，已被证明具有多向分化潜能，但存在以下缺点随着年龄的老化，干细胞数目显著降低增殖分化能力大幅度衰退移植给异体可能引起免疫反应取材时对患者有损伤。最近的研究显示，人羊膜间充质干细胞，不论在临床还是基础研究中，都具有诸。

2、白对照组周和周时筋膜层组织可见排列疏松的脂肪层与脂肪层下方整齐排列的横纹肌，无肉芽组织及炎性细胞浸润。阴性对照组周时皮下组织结构紊乱，层次表现不明显，大量中性粒细胞将组织包绕，基底层偶见浆细胞，局部炎症较为典型周时可见术区大量空泡状脂肪细胞及疏松结缔组织，肉芽组织及新生血管减少，偶见中性粒细胞浆细胞，炎症反应减退。实验组周时相较于阴性对照组炎症反应更为明显，肉芽组织及纤维组织增生，可见术区肌肉萎缩，炎性细胞浸润周时炎性细胞明显减少，组织排列趋于整齐，可见淡粉色的被覆上皮组织，高度认为是人脱细胞羊膜结构，其表面可见大量细胞附着生长。见图。蛋白免疫组织化学染色空白对照组镜下可见排列疏松的结缔组织，组织排列整齐，。

3、表。表目的基因引物序列及产物长度基因转染人羊速度离心，收集上清液为病毒原液，转移至超速离心管中，在低温离心机中以速度离心，完成离心后取出超速离心管，将病毒浓缩液分装臵于冰箱保存。慢病毒扩增取病毒保存液，加入培养基，十字形慢慢混匀。调整细胞计数为，于培养皿中加入培养基培养细胞，培养后移去培养液，加入病毒混合液，小心混匀，孵箱中培养，再加入培养基，继续孵箱中培养，稀释计数法估计病毒滴度。主要观察指标基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后韧带分化相关基因和蛋白表达，以及者复合培养后植入大鼠体内后的相关生物相容性指标。统计学分析采用统计学软件分析，结果以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用。

4、结果显示，人羊膜间充质干细胞具有良好的体外增殖活性，并且在大鼠体内周后也依然能够观察到人羊膜间充质干细胞在人脱细胞羊膜中生长，这也验证了人羊膜间充质干细胞高丰度高增殖活性的特点，是构建组织工程化韧带理想的种子细胞。图苏木精。型胶原表达使用免疫荧光染色在共培养时检测成韧带相关蛋白型胶原的表达和分布情况。相比较于未转染组的人羊膜间充质干细胞，基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后型胶原表达的荧光强度和密度显著增高，见图。免疫荧光定量结果显示型胶原蛋白表达显著高于未转染组，见图。疫原性细胞支架复合物移植入大鼠背部皮下周和周时收集样本行苏木精伊红染色，周时收集样本行免疫组织化学染色。苏木精伊红染色空。

5、，孵箱中培养，再加入培养基，继续孵箱中培养，稀释计数法估计病毒滴度。慢病毒转染细胞将人羊膜间充质干细胞浓度调整为，接种于孔板内培养，加入含聚凝胺的培养基，加入适量慢病毒悬液，在条件下孵育，更换培养基，转染后后观察细胞内荧光表达。检测基因表达以第代人羊膜间充质干细胞作为对照，以作为内参，取转染后细胞融合率达到的细胞，弃培养基，冲洗次，向孔板中加入，充分吹打促进细胞裂解，提取细胞总，反转录得到，并以之为模板进行反应。反转录聚合酶链式反应加样体系反应条件遵照操作说明书，以样本值作为统计参数，实验组实验组目的基因值实验组内参基因值，对照组对照组目的基因值对照组内参基因值，实验组对照组，目的基因相对表达量。引物序列见。

6、多的优势，人羊膜间充质干细胞来源于废弃的胎盘组织，次提取获得的细胞较多，来源广泛细胞丰度较高无伦理等限制，在组织工程研究中受到广泛的关注。慢病毒转染细胞将人羊膜间充质干细胞浓度调整为，接种于孔板内培养，加入含聚凝胺的培养基，加入适量慢病毒悬液，在条件下孵育，更换培养基，转染后后观察细胞内荧光表达。检测基因表达以第代人羊膜间充质干细胞作为对照，以作为内参，取转染后细胞融合率达到的细胞，弃培养基，冲洗次，向孔板中加入，充分吹打促进细胞裂解，提取细胞总，反转录得到，并以之为模板进行反应。反转录聚合酶链式反应加样体系反应条件遵照操作说明书，以样本值作为统计参数，实验组实验组目的基因值实验组内参基因值，对照组摘要背景。

7、无肉芽组织及炎入大鼠背部皮下筋膜，阴性对照组在大鼠背部做切口，不植入材料，空白对照组不做任何处理，术后，周取术区组织进行苏木精伊红染色，术后周取术区组织行蛋白免疫组化染色。结果与结论基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜复合培养可显著上调韧带分化相关基因型胶原型胶原纤维连接蛋白细胞连接素的表达水平术后周时实验组大鼠局部组织可见新生肉芽组织，炎症反应较阴性对照组空白对照组重术后周时实验组大鼠局部组织排列趋于整齐，肉芽组织减少，炎症明显消退术后周时实验组蛋白表达阳性，局部组织排列整齐，羊膜组织周围已经有大量细胞附着结果表明，基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架共培养可促进人羊膜间充质干细胞体外成韧带分。

8、着，已广泛运用于皮肤角膜软骨等组织修复并取得良好疗效，且其富含细胞外基质作为细胞支架非常适合用于干细胞的体外培养，。该实验也同样证明了基因协同诱导人羊膜间充质干细胞成韧带分化过程中，人脱细胞羊膜支架起到了积极的调控作用。图基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合物植入大鼠背部皮下周和周病理切片观察苏木精伊红染色图基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜复合物植入大鼠背部皮下周时的蛋白表达免疫组化染色实验将负载目的基因的慢病毒转染第代人羊膜间充质干细胞，构建可以向肌腱细胞分化的基因转染人羊膜间充质干细胞，将基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养复合物植入大鼠体内筋膜下，术后周时实验组局部组织的。

9、，该细胞支架复合物在动物体内表现出较好的生物相容性。关键词干细胞羊膜脱细胞间充质干细胞韧带膝关节韧带损伤是临床骨科中常见的膝关节损伤之，主要由运动损伤造成，常导致关节积液肌肉无力功能减退等。膝关节损伤中多以前交叉韧带损伤为主，前交叉韧带损伤后愈合能力差，不治愈率高，临床中常需要重建修复手术，目前常用的重建移植物主要有自体肌腱如腘绳肌腱股薄肌和半腱肌等，异体韧带如韧带。即使在使用自体肌腱或异人脱细胞羊膜支架促进修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化骨科缩液分装臵于冰箱保存。慢病毒扩增取病毒保存液，加入培养基，十字形慢慢混匀。调整细胞计数为，于培养皿中加入培养基培养细胞，培养后移去培养液，加入病毒混合液，小心混匀。

10、与结论基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜复合培养可显著上调韧带分化相关基因型胶原型胶原纤维连接蛋白细胞连接素的表达水平术后周时实验组大鼠局部组织可见新生肉芽组织，炎症反应较阴性对照组空白对照组重术后周时实验组大鼠局部组织排列趋于整齐，肉芽组织减少，炎症明显消退术后周时实验组蛋白表达阳性，局部组织排列整齐，羊膜组织周围已经有得新组织生长的空隙，。羊膜作为最早使用的生物材料，其富含及型胶原蛋白为其提供了定的拉伸强度和力学特性，人羊膜具备低免疫原性贴附性延展性，移植后对受体不会产生明显的免疫排斥反应，同时因为人羊膜具备良好的细胞外基质成分，在组织工程领域被认为是良好的生物支架，其具有良好的孔隙率有利于细胞附。

11、炎症反应消退，染色可见大量细胞种子细胞来源。人羊膜间充质干细胞表现出很高的分化潜能，近年来已经有诸多人羊膜间充质干细胞在骨组织工程中应用的报道。等分别诱导人脂肪间充质干细胞骨髓间充质干细胞和人羊膜间充质干细胞分化，培养，后发现人羊膜间充质干细胞组细胞外基质糖胺聚糖和型胶原含量显著高于另外两组，表明了人羊膜间充质干细胞成骨和成软骨具有更大的分化潜能。等在破骨细胞骨吸收过程中发现转化生长因子从骨基质中释放并激活，并通过信号通路诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。邹刚等使用含转化生长因子和血管内皮生长因子的培养基培养第代人羊膜间充质干细胞，随时间延长实验组韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因型胶原型胶原纤维连接蛋白。

12、脱细胞羊膜为种天然的生物材料支架，已广泛应用于组织工程的相关领域。基因在结缔组织如韧带等形成中具有重要的调控作用。目的验证修饰人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合物在大鼠体内的生物相容性。方法取足月产胎盘羊膜组织，采用化学酶消法对人新鲜羊膜进行脱细胞处理。两步酶消化法从人新鲜羊膜分离人羊膜间充质干细胞。运用慢病毒转染第代人羊膜间充质干细胞，然后与人脱细胞羊膜复合培养，时检测成韧带相关基因的表达。将只大鼠随机分为组实验组将已经制备的细胞支架复合物植入大鼠背部皮下筋膜，阴性对照组在大鼠背部做切口，不植入材料，空白对照组不做任何处理，术后，周取术区组织进行苏木精伊红染色，术后周取术区组织行蛋白免疫组化染色。结。

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