胞向胰岛细胞直接重编程过程中，由于肝细胞内源转录因子呈沉默状态以及表观遗传分子障碍的存在，造成直接重编程的细胞效率低和成熟度差，实验构建了靶向激活，和的体系，可持续激活细胞内特定转录因子，结合转座子系统，多重激活肝细胞系的内源高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文对的条表达载体按照∶∶的比例利用联合转染细胞，在转染第天，收集细胞，及免疫荧光验证。检测法提取总，反转录试剂盒日本公司将总反转录为，按照试剂盒日本公司说明书设臵反应体系及反应条件，根据公式计算基因相对于的表达量。技术是继锌指核酸酶，及转录激活样效应物核酸酶内源基因，已在体内外实现人间充质干细胞向汗腺样细胞人包皮成纤维细胞向类睾丸间质细胞皮肤成纤维细胞向诱导多能干细胞星形胶质细胞向功能性神经元细胞和肝细胞向胰岛分泌细胞的重编程，。肝细胞向胰岛细胞直接重编程过程中，由于肝细胞内源转录因子呈沉默状态以及表观遗传分子障碍的存在，造成直接重编程的细胞效率低和成熟度差，实验构建了靶向激活，和的体系，可持续激活细胞内特定转录因子，结合转座子系统，多重激活肝细胞系的内源表达，并实现内源性基因持续高水平表以及转座子均委托美国基因组医学实验室设计和制备。针对人源启动子区域的条靶向位点序列，见表。人源以及特定性引物增强型绿色荧光蛋白，由广州艾基生物技术有限公司合成，引物序列见表。技术是继锌指核酸酶，及转录激活样效应物核酸酶，免疫细胞荧光及显微镜观察细胞加入多聚甲醛室温固定。固定后的细胞用体积分数室温封闭，与相应抗孵育过夜。各抗体稀释比例如下，∶，∶，∶，∶。洗涤次。再分别与相应抗室温下结合，洗涤次。孵育，用荧光显微镜观察及拍摄。主要观察指标建立的体系是否能激活内源基因，及表达筛选和细胞株中针对，及启动子区域的最佳建立的多西环素诱导，收集细胞，及免疫荧光检测蛋白的表达。在上述细胞中，将转座子与载体质粒按照质量比∶进行转染，后潮霉素筛选后，扩大培养。加入多西环素诱导，收集细胞，及免疫荧光检测蛋白的表达，并最终获得稳转细胞系。免疫印迹检测各组细胞经冷洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，应用法定量蛋白浓度。取蛋白进行于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，验中用到的转座子可将快速插入人类细胞中以激活基因，激活蛋白质编码基因的转录，无需将慢病毒递送到细胞中即可实现。实验利用系统构建了稳定表达体系中的与激活子的细胞系，通过导入针对的条组合，靶向激活肝细胞内的共个胰腺特定转录因子，初步获得了表达胰岛素的细胞，重编程效率为。综合肝细胞系在体外直接重编程条件限制，提高该方法导入体内途径的安全性，并可跨越干细胞阶段而无畸胎瘤的顾虑，这为下步研究体内直接重编程肝细胞为胰岛素分泌组合靶向特定基因启动子区的多个位点，对于内源基因的激活是必需的。实验中，实验设计针对，及转录因子的多个，并分别在及细胞系中筛选到了特异性高，激活效率高的候选系统。同时，证明了导入条的激活效率相对于单独导入条有叠加效应，表明系统实现靶基因特异性激活调控，调控呈现协同效应。同样地，等发现在同细胞内共表达与针对的个组合，可显著提高的蛋白表达水平，这种协同作用是通过多个激活递增，导入条激活组的重编程细胞数目逐渐增加，在时重编程效率最高，但在后，重编程的细胞数目不再增加，见图，。图慢病毒载体图谱图转座系统结构图靶向激活，及的体系建立及验证讨论目前已有研究实现了肝细胞直接重编程为胰岛细胞，成功避免了干细胞分化途径的安全性问题，但是不同成熟体细胞之间的表观遗传学障碍导致胰岛细胞效率低成熟度差。基于的系统是可在不同的位点实现多基因的同时调控，并可招募多个同种效应蛋白，使其效应增强，高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文将蛋白转移至膜。各膜经含的室温摇床上封闭，洗涤次后与相应抗孵育过夜，各抗体稀释比例如下鼠抗人抗体∶美国公司鼠抗人抗体∶美国公司鼠抗人抗体∶北京全式金生物公司。洗涤遍，再分别与鼠抗∶室温下孵育，洗涤后经发光液显影，凝胶成像分析系统扫描条带，以为参照，和表达的相对含量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示。高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文中国病理生理杂志王皓毅，李劲松，李伟基于新型基因编辑技术研究生命科学王晗月，李富荣，杨晓菲，胡巢凤高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞中国组织工程研究，基金国家自然科学青年基金，项目负责人杨晓菲国家自然科学基金，项目负责人李富荣广东省自然科学基金项目，项目负责人杨晓菲深圳市科创委基础研究自由探索项目，项目负责人杨晓菲。在细胞中，将转座子与载体质粒按照质量比∶进行转染。后筛选后，扩大培养。加入照，和表达的相对含量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示。图体系示意图图转座及切离修复机制体系将肝脏细胞系重编程为胰岛样细胞向稳转细胞系中分别导入针对，及启动子的条，检测内源基因的相对表达水平，结果显示基因上调倍，基因上调倍，基因上调倍。同时导入针对个基因的条后，基因表达上调倍，基因表达上调倍，基因表达上调倍，见图，说明体系可以高效靶向激活。免细胞奠定了基础。综上所述，实验利用基于构建的新型体系，靶向激活内源共个关键转录因子，实现了肝细胞向胰岛样细胞的初步转化，为细胞直接重编程治疗糖尿病提供了新的技术方案和理论依据。图筛选针对，和启动子区域的最佳图稳转细胞系的鉴定图在细胞系中靶向激活，及的体系图肝脏细胞系重编程为胰岛样细胞参考文献任丽伟，杨晓菲，李富荣细胞直接重编程治疗糖尿病的新技术子结合到同启动子区域而形成的。细胞直接重编程是个干预基因表达的复杂过程，其方法添加小分子及导入转录因子等。实验在编程的培养基中加入，胰高血糖素样肽拮抗剂及种多聚核糖合成酶等因子促进胰岛素分泌细胞的转化和成熟，但利用体系进行肝细胞重编程的效率仍较低，可能与条转染后进入同细胞的效率较低有关，如将上述组合串联构建入同载体，将会提高重编程效率。另外，明确体系激活内源基因的机制，将会促进该方法在细胞直接重编程中的应用。也可以招募不同的效应蛋白，协同调控基因表达。从而使胰岛谱系的内源基因持续高表达，实现肝细胞的高效重编程。实验中利用基于构建的新型体系，通过设计分别针对，及启动子区域的条，可在细胞内高效激活相应的内源转录因子。结合转座子实现了及片段在肝细胞系基因组的整合，并实现细胞向胰岛样细胞的初步转化。体系中的序列特征以及设计特异性好的靶点是实验成功的关键因素，据报道，利用多个荧光结果显示，相对于及过表达质粒，见图，体系可以实现及蛋白的明显表达，进步证实了体系激活内源基因的作用，见图。实验分别向稳转细胞系中导入条以激活和只导入激活的条，在的因子诱导条件下，两组均能实现肝细胞向胰岛素分泌细胞的重编程，重编程效率可以达到，见图，导入条激活组的重编程细胞数目高于只导入的条的重编程细胞数目。随着时间高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文疫印迹检测各组细胞经冷洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，应用法定量蛋白浓度。取蛋白进行于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至膜。各膜经含的室温摇床上封闭，洗涤次后与相应抗孵育过夜，各抗体稀释比例如下鼠抗人抗体∶美国公司鼠抗人抗体∶美国公司鼠抗人抗体∶北京全式金生物公司。洗涤遍，再分别与鼠抗∶室温下孵育，洗涤后经发光液显影，凝胶成像分析系统扫描条带，以为参下结合，洗涤次。孵育，用荧光显微镜观察及拍摄。主要观察指标建立的体系是否能激活内源基因，及表达筛选和细胞株中针对，及启动子区域的最佳建立的稳转细胞系中及片段是否稳定表达体系将肝脏细胞系重编程为胰岛样细胞的重编程效率。统计学分析使用软件进行统计分析。数据以表示。两组间均数比较采用独立样本检验，以为差异有显著性意义。在表达，并实现内源性基因持续高水平表达，初步验证了肝细胞向胰岛样细胞的直接重编程。材料和方法设计分子生物学及细胞形态学观察实验。高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文。时间及地点于年月至年月在深圳市人民医院转化协同中心完成。材料细胞和细胞系均由中国科学院干细胞库提供。基因载体及序列基于的表达质粒和，和向导，和以及转座子均委托美国，之后重要的新型基因编辑技术，。基于的体系由至少个和模块效应蛋白与蛋白的融合蛋白组成，该系统通过改造序列，可与多个转录激活子或结合，从而实现高效靶向激活多个特定转录因子，使内源性基因持续高水平表达。该系统可以招募不同的效应因子到基因组的特定靶点，发挥转录调控表观遗传学修饰等功能，从而实现多种基因组水平的操作。相关研究表明，初步验证了肝细胞向胰岛样细胞的直接重编程。材料和方法设计分子生物学及细胞形态学观察实验。高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞内分泌科论文。表引物序列表慢病毒载体名称及元件信息体系建立及验证所需的组件包括至少个，以及模块。作为带有个或多个结合位点的，针对转录起始位点上游的位臵，选取激活的位臵，见图，每个基因