杆菌中，液体培养基摇菌，用添加乙酰丁香酮，的液体培养基重悬菌体，分别侵染本生烟草叶片和普通烟草生质体，后于激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白。蛋白序列分析用在线分析软件进行开放阅读框预测分析，蛋白质级结构用在线软件进行分析，亚细胞定位用在线软件��地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文，和糖基转移酶作用下经缩合糖苷化修饰而来。属于酰基辅酶依赖的超家族，已经鉴定出来些的家族成员在药用植物次生代谢产物的形成中发挥重要的作用，如长春花罂粟啡花青素迷迭香酸等。本研究从地黄毛状根中鉴定出个响应水杨酸诱导的基因，推测其可能参与毛蕊花糖苷的生物合成，并将其重新命名为。本研究对鉴定出的与毛蕊花糖苷生物合成相关的关键酶基因与来源于杨属的毛白杨同源蛋白分别聚在起。试剂提取试剂盒反转录试剂盒实时荧光定量检测试剂盒高保真聚合酶等均购买于公司乙酰丁香酮和粉购于公司融合表达载体由武汉伯远生物构建农杆菌感受态细胞购于上海维地生物琼脂糖和胶回收试剂盒购于天根生化科技北京有限公司酵母提取物和胰蛋白胨购于公司。方法的提取和反转录取液氮保存的地黄的系统进化分析为了分析地黄与其他植物同源蛋白的亲缘关系，又下载了水稻玉米序列，对条氨基酸序列进行进化分析，构建系统进化树，结果图表明，个蛋白明显分为个类群，水稻玉米和小麦个物种均为单子叶植物，它们的个蛋白聚在起，其余个蛋白均来源于双子叶植物，聚为个大的类群。地黄与来源于胡麻科芝麻和来源于个唇形科植物红鼠尾草欧活血丹蛋白聚在起，同属唇形目，序列致性高，序列相似性分为了分析地黄序列与其它已经报道的同源蛋白的序列相似性，从下载了芝麻拟南芥丹参和大豆的氨基酸序列，进行多序列联配，结果图表明，地黄与这些蛋白的序列相似性很高，序列致性在，特别是在植物保守的和个，在不同的蛋白间高度保守。进而又下载了与序列相似性较高的其它个物种的同源蛋白序列，利用羟基肉桂酰基转移酶基因，其中编号为的转录本在水杨酸处理后的毛状根中表达量分别比未处理对照提高倍，与水杨酸促进地黄毛蕊花糖苷的积累呈正相关。利用预测其具有完整的开放阅读框，编码序列为，非编码序列和分别有和，推测其编码的蛋白质序列有，命名为。根据编码区设计基因特异引物进行扩增，获得条的条带图，连接到克隆载体上测序，结果与原序列完全致。图地黄基因的扩增产物检测地黄基因的序列分析用在线工具胞定位和表达模式。方法在地黄的转录组数据库中通过注释和比对，获得地黄的序列，利用聚合酶链式反应方法进行分子克隆。构建绿色荧光蛋白融合表达载体，以农杆菌瞬时表达法观测的亚细胞定位。利用实时荧光定量检测基因在地黄块根不同部位的表达模式。结果获得地黄个莽草酸羟基肉桂酰基转移酶的全长编码序列，长度为，包含个的开放阅读框，编码个氨基酸残基，蛋白质相对分子质量为，具有莽草酸羟基肉桂酰基转移酶的典型结构域，命名为预测其具有完整的开放阅读框，编码序列为，非编码序列和分别有和，推测其编码的蛋白质序列有，命名为。根据编码区设计基因特异引物进行扩增，获得条的条带图，连接到克隆载体上测序，结果与原序列完全致。图地黄基因的扩增产物检测地黄基因的序列分析用在线工具分析地黄蛋白的理化性质，结果发现的相对分子质量为，理论等电点为。蛋白带负电荷残基为，带正电荷残基为，与来源于胡麻科芝麻和来源于个唇形科植物红鼠尾草欧活血丹蛋白聚在起，同属唇形目，序列致性高，序列相似性分别为，为类群。其他蛋白的亲缘关系也与植物的亲缘关系具有较强的相关性，如来源于茄科的番茄马铃薯辣椒野生烟草的蛋白同属于类群，来源于菊科的紫锥菊地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文分析地黄蛋白的理化性质，结果发现的相对分子质量为，理论等电点为。蛋白带负电荷残基为，带正电荷残基为，不稳定指数为，为稳定蛋白，为，为亲水性蛋白。以的氨基酸序列在上进行结构域搜索，发现其包含个羟基棕榈酸酯阿魏酰转移酶的结构域，与来自芝麻序列致性高药材，在中药处方中使用频率排在前位。地黄含有丰富的苯乙醇苷环烯醚萜苷紫罗兰酮酚酸糖等多种化学成分，对心脑血管系统免疫系统中枢系统脏腑系统具有显著的药理作用。毛蕊花糖苷是地黄中含量较高的苯乙醇苷类成分，也是中国药典年版规定的个指标性成分之，具有免疫调节肾脏保护抗氧化抗高血压等多种生物学活性，在列当科玄参科胡麻科马鞭草科车前科等多种植物中均含有毛蕊花糖苷。地黄毛蕊花糖苷的含量易受产地品种采收时期等因素的影响。结果与分析地黄基因的克隆在课题组已有地黄转录组数据库中，有个转录本注释为莽草酸列相似性很高，序列致性在，特别是在植物保守的和个，在不同的蛋白间高度保守。进而又下载了与序列相似性较高的其它个物种的同源蛋白序列，利用在线软件对这个蛋白的氨基酸序列进行保守的基序挖掘，发现图基序和基序分别包含在个不同的长的基序内，而且序列高度致，说明基序和基序在这些蛋白发挥转移酶活性时非常重要。用在线软件对的蛋。亚细胞定位结果显示主要分布在细胞质中，在细胞核中也有分布。分析表明，在地黄的周皮和根毛中表达量较高，在木质部和韧皮部表达量较低。基因在地黄品种北京号和中非菊花心中表达量均高于菊花心中的表达量，且差异达极显著水平。结论获得地黄的序列，明确了的亚细胞定位和时空表达模式，为进步研究基因在毛蕊花糖苷合成过程中的作用奠定基础。关键词亚细胞定位地黄序列分析毛蕊花糖苷合酶地黄大怀药之，其药用历史悠久，药效明确，是常用的大不稳定指数为，为稳定蛋白，为，为亲水性蛋白。以的氨基酸序列在上进行结构域搜索，发现其包含个羟基棕榈酸酯阿魏酰转移酶的结构域，与来自芝麻序列致性高达。地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文。摘要目的克隆地黄毛蕊花糖苷合酶基因，分析其亚菊苣黄花蒿和刺苞菜蓟蛋白属于类群，来源于番薯属的番薯与来源于杨属的毛白杨同源蛋白分别聚在起。结果与分析地黄基因的克隆在课题组已有地黄转录组数据库中，有个转录本注释为莽草酸羟基肉桂酰基转移酶基因，其中编号为的转录本在水杨酸处理后的毛状根中表达量分别比未处理对照提高倍，与水杨酸促进地黄毛蕊花糖苷的积累呈正相关。利用白进行维结构预测，建模模板为彩叶草，发现图由个折叠和个螺旋组成，个大的由个连接环连接。图的序列特征地黄氨基酸序列的系统进化分析为了分析地黄与其他植物同源蛋白的亲缘关系，又下载了水稻玉米序列，对条氨基酸序列进行进化分析，构建系统进化树，结果图表明，个蛋白明显分为个类群，水稻玉米和小麦个物种均为单子叶植物，它们的个蛋白聚在起，其余个蛋白均来源于双子叶植物，聚为个大的类群。地黄地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文，抑制剂，加无酶的去离子水补足体积为。反应的程序为地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文。为了分析地黄序列与其它已经报道的同源蛋白的序列相似性，从下载了芝麻拟南芥丹参和大豆的氨基酸序列，进行多序列联配，结果图表明，地黄与这些蛋白的黄。地黄出苗后左右，随机选取生长良好的株，分离其膨大块根的周皮韧皮部木质部根毛挑选生长良好的北京号和植株，每个品种随机选取株，分离其块根的菊花心和非菊花心部位，于液氮中速冻保存。地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆亚细胞定位与表达特性分析药物分析论文。试剂提取试剂盒反转录试剂盒实时荧光定量检测试剂盒高保真聚合酶等均购买于公司乙酰丁香酮和粉购于公司进行预测，氨基酸多序列比对用在线软件和序列编辑软件进行分析。用构建系统进化树。在前人关于植物毛蕊花糖苷合成途径的研究基础上，课题组进步推导出毛蕊花糖苷是由咖啡酰基辅酶和羟基酪醇苷在莽草酸羟基肉桂酰基转移酶，和糖基转移酶作用下经缩合糖苷化修饰而来。属于酰基辅酶依赖的超家族，已经鉴定出来些进行系统的鉴定与分析，为进步揭示毛蕊花糖苷的分子合成机制提供参考。材料与试剂材料怀地黄品种北京号和，种植于温县武德镇河南农业大学中药材良种繁育基地，经河南农业大学王丰青副教授鉴定为地黄。地黄出苗后左右，随机选取生长良好的株，分离其膨大块根的周皮韧皮部木质部根毛挑选生长良好的北京号和植株，每个品种随机选取株，分离其块根的菊花心和非菊花心部位，于液氮中速冻保存。亚细胞定位根据基因的编码区序列设计特异引物进行扩增，利用酶样品放入预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉，每个样品取约，用公司的提取试剂盒进行总提取。反转录利用反转录试剂盒型，反应体系为总，反转录酶，引物抑制剂，加无酶的去离子水补足体积为。反应的程序为在前人关于植物毛蕊花糖苷合成途径的研究基础上，课题组进步推导出毛蕊花糖苷是由咖啡酰基辅酶和羟基酪醇苷在莽草酸羟基肉桂酰基转移酶别为，为类群。其他蛋白的亲缘关系也与植物的亲缘关系具有较强的相关性，如来源于茄科的番茄马铃薯辣椒野生烟草的蛋白同属于类群，来源于菊科的紫锥菊菊苣黄花蒿和刺苞菜蓟蛋白属于类群，来源于番薯属的番薯在线软件对这个蛋白的氨基酸序列进行保守的基序挖掘，发现图基序和基序分别包含在个不同的长