放学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。实验仪器设备洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂仪器电子天平上海良平仪器有限公司电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司恒温气浴摇床常州市博宏高科试验设备有限公司手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂隔水式恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂数显恒温水浴锅国华电器有限公司基因扩增热循环仪西安天隆科技有限公司电泳仪北京市六仪器厂多功能水平电泳槽北京市六仪器厂漩涡混合器上海琪特分析仪器有限公司热磁力搅拌器台式高速离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司可见紫外检测仪上海市顾村电光仪器厂实验步骤菌种培养配制培养基培养基在锥形瓶中配制完成并溶解。液体培养基胰蛋白胨，酵母粉。固体培养基液体培养基添加的琼脂。灭菌将平板块与装有培养基的锥形瓶分别包扎，移液枪枪头与的离心管置于密封容器中，用高压蒸汽灭菌锅灭菌。倒平板待培养基冷却至左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基左手将培养皿打开条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。菌种活化待平板冷却凝固后，划平板，接柠檬酸杆菌和柠檬酸杆菌的菌种，放置片刻，将平板倒置，防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。最后放入恒温培养箱，过夜培养，第二天，观察菌种活化情况，情况较好可放入冰箱保存。扩大培养将培养好的培养皿不要打开皿盖用的酒精擦拭，放进无菌超净台中，用酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却，用接种环挑取培养皿上的菌落，将接种环伸入经过灭菌的液体培养基，摇晃接种环，使菌种均匀分散到培养液中，然后包扎封口锥形瓶，将接种后的锥形瓶放入摇床过夜培养。培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。培养皿继续放入冰箱保存。法制备细菌基因组菌体收集取已经培养过夜的弗氏柠檬酸杆菌菌悬液或于离心管中，离心，弃上清，收集菌体注意吸干多余的水分。辅助裂解阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。加入溶菌酶，处理。裂解向每管加入裂解缓冲液，乙酸钠，用枪头反复吹打以悬浮和裂解细菌细胞。接着向每管加入，充分混匀后，离心，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。将上清液转移到新离心管中，加入等体积的用饱和的苯酚，充分混匀后，离心，进步沉淀蛋白质。取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，组弗氏柠檬酸杆菌基因组弗氏柠檬酸杆菌基因组分析讨论及注意事项当太多，胶染色过深,带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，分钟后再观察。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害。异戊醇其蒸气或雾对眼睛皮肤粘膜和呼吸道有刺激作用实验中，试剂的配制是重要的，如果试剂出现，下面的操作就没有意义了。在配制试剂时，所有的称量要准确。电子天平都要预热后才可以进行使用。配制试剂时，不可照书加试剂，例如在配制缓冲液的需要严格控制的试剂时，定要用试纸进行测试。在做电泳操作时，为致癌物质，所以使用时要格外小心，同时也不可将其他区域污染。抽提转化及制备感受态细胞时，温度要控制的很好，同时动作要轻，不能剧烈。预混和分装试剂反应液应预先配制好，然后小量分装。节省时间并保证各管成分平行。最好在加样时都在冰上低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清不要随便丢弃，应存放在起进行灭菌处理，以免污染环境。防止核酸污染反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。吸样枪吸样枪污染值得注意操作时应避免将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头。开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免污染。结论技术具有适用面广的特点,自发明以来,已在病毒感染的临床检测,癌症的临床诊断,遗传病的早期诊断中得以应用应用技术可使单个未形成病毒颗粒的分子迅速扩增至诊断量可从细胞中检出个癌变细胞可快速简便且较为安全地进行遗传性疾病的胎儿期诊断从而使临床分析上升到了分子生物学检测水平致谢由衷的感谢韦老师，老师们渊博学识和严谨学风将使我受益终生，激励我在未来的学习和工作中不断奋进。在生活上，给予了很大的关怀，在学业上，给予了耐心的指导，使我顺利地完成了学业。衷心的感谢邱老师平时对我们孜孜不倦的教诲和对实验的关心与指导，老师治学严谨，为人热诚大方，工作丝不苟，使我受益颇多。在读期间，得到了常州工程职业技术学院制药系候老师彭老师等老师和同学的无私帮助和大力支持，在此并表示深切的感谢,最后，感谢曾经给予我鼓励支持和帮助的朋友们同学们,参考文献韦平和，彭加平，营佳酪氨酸酚裂解酶及其在酪氨酸酶法合成中的应用中国生化药物杂志李华钟,孙伟,刘吉泉,陈坚弗氏柠檬酸细菌酪氨酸酚解酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达工业微生物李伟平，王树英，严群，李华钟构建高表达酪氨酸酚裂解酶重组大肠杆菌合成左旋多巴中国医药工业杂志刘志国，屈伸基因克隆的分子基础与工程原理北京化学工业出版社，赵亚力，马学斌，韩为东聚合酶链反应分子生物学基本实验技术年月第版页。离心，去除苯酚。小心取出上清液，用预冷的二倍体积的无水乙醇沉淀，室温放置以上，离心,弃上清液。沉淀质粒用乙醇洗涤沉淀次，离心，弃上清液。沉淀在室温下倒置干燥或真空干燥。不要太干，否则不易溶解加入含的缓冲液或无菌双蒸水，使溶解，置水浴，除去。冷却至室温后，将样品储存在冰箱中使用。电泳检测制备琼脂糖凝胶按照被分离的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表琼脂糖凝胶浓度线状的有效分离范围本实验选择的琼脂糖凝胶液称取琼脂糖，放入锥形瓶中，加入缓冲液，至微波炉加热至完全溶化，取出摇匀。胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净，晾干平衡凝胶槽，放好胶板，调节好梳子与底板的距离将加入冷却至左右的琼脂糖凝胶液中，轻轻混匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成层均匀的胶面注意不要形成气泡。④待胶彻底凝固后，轻轻拔出梳子将内槽入电第地面的相对速度成正比计算地震反应时振动时网架的下部结构各部分与地面做同运动计算地震反应时。网架结构的地震反应分析网架结构在地震作用下所有节点的振动方程写成矩阵形式为式中，为阻尼系数矩阵，般取阻尼，即为相对于地面的相对位移列矩阵为相对速度列矩阵为相对加速度列矩阵为地面运动加速度列矩阵关于式的求解，本文利用时程分析法直接进行求解。时程分析法又称直接动力法，在数学上亦称逐步积分法，它是对结构物的运动微分方程直接进行逐步积分求解的种动力分析法。逐步积分法的计算过程是根据动力学方程，引进些假设，建立由时刻结构状态向量到时刻状态向量的递推关系式，从而从时刻的状态向量出发，步步地求出各时刻的状态向量。常用的有线性加速度法法，法，以及精度较高的高阶单步法。网架结构的随机振动谱分析随机振动谱分析是种将模态分析结果和已知谱联系起来，然后计算模型位移和应力的分析技术，主要用于模型在确定载荷或随机载荷作用下，获得结构的响应情况。地震激励响应是建筑结构需要考虑的关键工况。本课题采用个典型地震位移谱来考察网架结构的地震频率响应。本文采用地面位移激励方法，将地震时地面位移波形以获得各时刻的垂直地面位移离散化，并将其输入为网架结构的地面连接处的位移来模拟地震的地面振动对结构的激励。由于整个网架是由柱子支撑的，所以地震的振动是通过柱子传输到整个网架上的，所以输入地震振动响应点就是网架模型的约束点。其具体值见表。表值引自文献表地震响应谱频率位移频率位移这里选取有较大位移变形的节点进行位移加速度速度响应谱分析。通过时间历程后处理器，获得图号节点在向上的频率位移加速度速度响应曲线如图图图。图位移响应曲线图加速度响应曲线图速度响应曲线在输入地震激励的载荷步后，计算网架结构频率响应。通过观察三个响应曲线图可以看出有个特殊时刻值得关注。在频率为附近时，不管是位移或加速度还是速度响应曲线值都达到了最大值。结构发生共振的频率值主要是在左右，这就是工程结构设计时要力求避免其固有频率落在这频率附近。此频率值与上述模态分析中的第阶振型相对应其低阶固有频率是。说明该网架结构的地震响应既有受迫振动又有结构共振。从模态分析得到的自振频率看，网架由于结构的低阶自振频率与共振频率接近，而高阶振型的峰值响应与第阶振型相比要高的多，所以在工程实际情况中主要考虑该网架的低阶频率易产生共振，从而应避免网架的低阶频率。结论本课题采用了美国建筑结构三维有限元分析软件软件作为研究工具，首先在中建立了网架的参数化模型，然后进行静动力特性分析。通过有限元软件的应用可得到以下结论本课题在建模过程中有效的采用了有限元软件自带语言建立参数化的模型，并确定载荷类型及边界条件的单元类型的选择。可以很有效的缩短了网架的建模的时间，简化了网架的建模过程。在对网架结构的静力分析时可看出，由于网架采用的是多点支承方式，支承点较多，当点支承不良时网架前后产生的变化很小，可得出当点支承不良放学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。实验仪器设备洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂仪器电子天平上海良平仪器有限公司电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司恒温气浴摇床常州市博宏高科试验设备有限公司手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂隔水式恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂数显恒温水浴锅国华电器有限公司基因扩增热循环仪西安天隆科技有限公司电泳仪北京市六仪器厂多功能水平电泳槽北京市六仪器厂漩涡混合器上海琪特分析仪器有限公司热磁力搅拌器台式高速离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司可见紫外检测仪上海市顾村电光仪器厂实验步骤菌种培养配制培养基培养基在锥形瓶中配制完成并溶解。液体培养基胰蛋白胨，酵母粉。固体培养基液体培养基添加的琼脂。灭菌将平板块与装有培养基的锥形瓶分别包扎，移液枪枪头与的离心管置于密封容器中，用高压蒸汽灭菌锅灭菌。倒平板待培养基冷却至左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基左手将培养皿打开条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。菌种活化待平板冷却凝固后，划平板，接柠檬酸杆菌和柠檬酸杆菌的菌种，放置片刻，将平板倒置，防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。最后放入恒温培养箱，过夜培养，第二天，观察菌种活化情况，情况较好可放入冰箱保存。扩大培养将培养好的培养皿不要打开皿盖用的酒精擦拭，放进无菌超净台中，用酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却，用接种环挑取培养皿上的菌落，将接种环伸入经过灭菌的液体培养基，摇晃接种环，使菌种均匀分散到培养液中，然后包扎封口锥形瓶，将接种后的锥形瓶放入摇床过夜培养。培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。培养皿继续放入冰箱保存。法制备细菌基因组菌体收集取已经培养过夜的弗氏柠檬酸杆菌菌悬液或于离心管中，离心，弃上清，收集菌体注意吸干多余的水分。辅助裂解阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。加入溶菌酶，处理。裂解向每管加入裂解缓冲液，乙酸钠，用枪头反复吹打以悬浮和裂解细菌细胞。接着向每管加入，充分混匀后，离心，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。将上清液转移到新离心管中，加入等体积的用饱和的苯酚，充分混匀后，离心，进步沉淀蛋白质。取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，组弗氏柠檬酸杆菌基因组弗氏柠檬酸杆菌基因组分析讨论及注意事项当太多，胶染色过深,带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，分钟后再观察。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害。异戊醇其蒸气或雾对眼睛皮肤粘膜和呼吸道有刺激作用实验中，试剂的配制是重要的，如果试剂出现，下面的操作就没有意义了。在配制试剂时，所有的称量要准确。电子天平都要预热后才可以进行使用。配制试剂时，不可照书加试剂，例如在配制缓冲液的需要严格控制的试剂