放学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。实验仪器设备洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂仪器电子天平上海良平仪器有限公司电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司恒温气浴摇床常州市博宏高科试验设备有限公司手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂隔水式恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂数显恒温水浴锅国华电器有限公司基因扩增热循环仪西安天隆科技有限公司电泳仪北京市六仪器厂多功能水平电泳槽北京市六仪器厂漩涡混合器上海琪特分析仪器有限公司热磁力搅拌器台式高速离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司可见紫外检测仪上海市顾村电光仪器厂实验步骤菌种培养配制培养基培养基在锥形瓶中配制完成并溶解。液体培养基胰蛋白胨，酵母粉。固体培养基液体培养基添加的琼脂。灭菌将平板块与装有培养基的锥形瓶分别包扎，移液枪枪头与的离心管置于密封容器中，用高压蒸汽灭菌锅灭菌。倒平板待培养基冷却至左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基左手将培养皿打开条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。菌种活化待平板冷却凝固后，划平板，接柠檬酸杆菌和柠檬酸杆菌的菌种，放置片刻，将平板倒置，防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。最后放入恒温培养箱，过夜培养，第二天，观察菌种活化情况，情况较好可放入冰箱保存。扩大培养将培养好的培养皿不要打开皿盖用的酒精擦拭，放进无菌超净台中，用酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却，用接种环挑取培养皿上的菌落，将接种环伸入经过灭菌的液体培养基，摇晃接种环，使菌种均匀分散到培养液中，然后包扎封口锥形瓶，将接种后的锥形瓶放入摇床过夜培养。培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。培养皿继续放入冰箱保存。法制备细菌基因组菌体收集取已经培养过夜的弗氏柠檬酸杆菌菌悬液或于离心管中，离心，弃上清，收集菌体注意吸干多余的水分。辅助裂解阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。加入溶菌酶，处理。裂解向每管加入裂解缓冲液，乙酸钠，用枪头反复吹打以悬浮和裂解细菌细胞。接着向每管加入，充分混匀后，离心，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。将上清液转移到新离心管中，加入等体积的用饱和的苯酚，充分混匀后，离心，进步沉淀蛋白质。取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，组弗氏柠檬酸杆菌基因组弗氏柠檬酸杆菌基因组分析讨论及注意事项当太多，胶染色过深,带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，分钟后再观察。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害。异戊醇其蒸气或雾对眼睛皮肤粘膜和呼吸道有刺激作用实验中，试剂的配制是重要的，如果试剂出现，下面的操作就没有意义了。在配制试剂时，所有的称量要准确。电子天平都要预热后才可以进行使用。配制试剂时，不可照书加试剂，例如在配制缓冲液的需要严格控制的试剂时，定要用试纸进行测试。在做电泳操作时，为致癌物质，所以使用时要格外小心，同时也不可将其他区域污染。抽提转化及制备感受态细胞时，温度要控制的很好，同时动作要轻，不能剧烈。预混和分装试剂反应液应预先配制好，然后小量分装。节省时间并保证各管成分平行。最好在加样时都在冰上低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清不要随便丢弃，应存放在起进行灭菌处理，以免污染环境。防止核酸污染反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。吸样枪吸样枪污染值得注意操作时应避免将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头。开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免污染。结论技术具有适用面广的特点,自发明以来,已在病毒感染的临床检测,癌症的临床诊断,遗传病的早期诊断中得以应用应用技术可使单个未形成病毒颗粒的分子迅速扩增至诊断量可从细胞中检出个癌变细胞可快速简便且较为安全地进行遗传性疾病的胎儿期诊断从而使临床分析上升到了分子生物学检测水平致谢由衷的感谢韦老师，老师们渊博学识和严谨学风将使我受益终生，激励我在未来的学习和工作中不断奋进。在生活上，给予了很大的关怀，在学业上，给予了耐心的指导，使我顺利地完成了学业。衷心的感谢邱老师平时对我们孜孜不倦的教诲和对实验的关心与指导，老师治学严谨，为人热诚大方，工作丝不苟，使我受益颇多。在读期间，得到了常州工程职业技术学院制药系候老师彭老师等老师和同学的无私帮助和大力支持，在此并表示深切的感谢,最后，感谢曾经给予我鼓励支持和帮助的朋友们同学们,参考文献韦平和，彭加平，营佳酪氨酸酚裂解酶及其在酪氨酸酶法合成中的应用中国生化药物杂志李华钟,孙伟,刘吉泉,陈坚弗氏柠檬酸细菌酪氨酸酚解酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达工业微生物李伟平，王树英，严群，李华钟构建高表达酪氨酸酚裂解酶重组大肠杆菌合成左旋多巴中国医药工业杂志刘志国，屈伸基因克隆的分子基础与工程原理北京化学工业出版社，赵亚力，马学斌，韩为东聚合酶链反应分子生物学基本实验技术年月第版页。离心，去除苯酚。小心取出上清液，用预冷的二倍体积的无水乙醇沉淀，室温放置以上，离心,弃上清液。沉淀质粒用乙醇洗涤沉淀次，离心，弃上清液。沉淀在室温下倒置干燥或真空干燥。不要太干，否则不易溶解加入含的缓冲液或无菌双蒸水，使溶解，置水浴，除去。冷却至室温后，将样品储存在冰箱中使用。电泳检测制备琼脂糖凝胶按照被分离的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表琼脂糖凝胶浓度线状的有效分离范围本实验选择的琼脂糖凝胶液称取琼脂糖，放入锥形瓶中，加入缓冲液，至微波炉加热至完全溶化，取出摇匀。胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净，晾干平衡凝胶槽，放好胶板，调节好梳子与底板的距离将加入冷却至左右的琼脂糖凝胶液中，轻轻混匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成层均匀的胶面注意不要形成气泡。④待胶彻底凝固后，轻轻拔出梳子将内槽入电。设计时，般将沉降缝与伸缩缝合并设置，沿路线方向每隔设置道，兼器两者的作用，缝宽，缝内般可用胶泥填塞，但在渗水量大，填料容易流失或冻害严重地区，则宜用沥青麻筋或涂以沥青的木板等具有弹性的材料，沿内外顶三方填塞，填深不宜小于。本路段为二级公路路基宽在处左右设计段路堤挡土墙计算资料墙身构造拟采用浆砌片石重力式路堤墙,如图所示,墙高,填土高,填土边坡墙背俯斜,倾角,墙身分段长度,初拟墙顶宽,墙底宽如下图车辆荷载计算荷载,汽车级验算荷载,挂车填料沙土湿密度,计算内摩擦角η,填料与墙背的摩擦角η。地基情况中密砾石土,容许承载力,基地摩擦系数墙身材料号水泥沙浆砌片石,砌体毛体积密度,容许压应力,容许切应力Т计算步骤车辆荷载换算计算荷载求破裂棱体宽度假设破裂面交于荷载内,求不计车辆荷载作用时的破裂棱体宽度η求纵向分布长度辆重车的扩散长度为大于挡土墙分段长度,取计算长度纵向布置辆重车,总重力为计算等代均布土层厚度车轮中心距路基边缘,,重车在破裂棱体内能布置辆验算荷载挂车,,布置在路基全宽主动土压力的计算设计荷载η破裂棱体宽度荷载外缘到路基内侧边缘的距离为,大于破裂棱体宽度,破裂面仍交于荷载内,与原假定相符,所以选用的公式正确η土压力作用点验算荷载η破裂棱体宽度接和协调,使之相互配合,形成完善的排水体系,迅速及时地将对路基路面产生影响的各种地表水和地下水加以排除。设计前必须进行充分的调查研究,以使排水系统的规划和黑色机做到正确合理。各种路基排水沟渠的设置应尽量少占农田,并与水利规划和土地使用规划等相配合,进行综合规划。般情况下,不应利用边沟作农业灌溉用,但不得已时,应采取加固措施以防水流危害路基。排水设计应经济适用。排水沟渠应选择在地形地质较好的地区范围通过,以节约加固工程量,对于排水困难和地质不良地段应进行特殊设计。排水沟渠的出水口应尽可能引接至天然河沟,以减少桥涵工程,不应直接使水流入农田,损害农业生产。排水设施的设计,应贯彻因地制宜就地取材的原则,以减少造价要能迅速有效的排除有害水,以免影响路基的强度和稳定性,保证公路运输的畅通。路基排水设计要注意环境保护,不破坏天然水系,不宜取消或合并自然沟渠和改变水流性质,尽量选择有利地形和地质条件分布设人工沟渠,减少排水沟渠的防护工程。排水明沟的计算已知设计流量,沟底纵坡,土壤为极密结的沙质土墙的基底宜做成不大于的纵坡。但地基为岩石时，为减少开挖，可沿纵向做成台阶，台阶尺寸视纵坡大小而定，但其高宽比不宜大于。Ⅳ布置泻水孔的位置，包括数量间隔和尺寸等。挡土墙的横向布置横向布置，选择在墙高最大处，墙身断面或基础形式有变异处以及其它必须桩号处的横断面图上进行。根据墙型墙高及地基与填料的物理力学指标等设计资料，进行挡土墙设计或套用标准图，确定墙身断面基础形式和埋置深度，布置排水设施等，并绘制挡土墙横断面图。平面布置对于个别复杂的挡土墙，如高长的沿河曲线挡土墙，应作平面布置，绘制平面图，标明挡土墙还应绘出河道及水流方向，防护与加固工放学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。实验仪器设备洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂仪器电子天平上海良平仪器有限公司电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司恒温气浴摇床常州市博宏高科试验设备有限公司手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂隔水式恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂数显恒温水浴锅国华电器有限公司基因扩增热循环仪西安天隆科技有限公司电泳仪北京市六仪器厂多功能水平电泳槽北京市六仪器厂漩涡混合器上海琪特分析仪器有限公司热磁力搅拌器台式高速离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司可见紫外检测仪上海市顾村电光仪器厂实验步骤菌种培养配制培养基培养基在锥形瓶中配制完成并溶解。液体培养基胰蛋白胨，酵母粉。固体培养基液体培养基添加的琼脂。灭菌将平板块与装有培养基的锥形瓶分别包扎，移液枪枪头与的离心管置于密封容器中，用高压蒸汽灭菌锅灭菌。倒平板待培养基冷却至左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基左手将培养皿打开条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。菌种活化待平板冷却凝固后，划平板，接柠檬酸杆菌和柠檬酸杆菌的菌种，放置片刻，将平板倒置，防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。最后放入恒温培养箱，过夜培养，第二天，观察菌种活化情况，情况较好可放入冰箱保存。扩大培养将培养好的培养皿不要打开皿盖用的酒精擦拭，放进无菌超净台中，用酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却，用接种环挑取培养皿上的菌落，将接种环伸入经过灭菌的液体培养基，摇晃接种环，使菌种均匀分散到培养液中，然后包扎封口锥形瓶，将接种后的锥形瓶放入摇床过夜培养。培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。培养皿继续放入冰箱保存。法制备细菌基因组菌体收集取已经培养过夜的弗氏柠檬酸杆菌菌悬液或于离心管中，离心，弃上清，收集菌体注意吸干多余的水分。辅助裂解阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。加入溶菌酶，处理。裂解向每管加入裂解缓冲液，乙酸钠，用枪头反复吹打以悬浮和裂解细菌细胞。接着向每管加入，充分混匀后，离心，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。将上清液转移到新离心管中，加入等体积的用饱和的苯酚，充分混匀后，离心，进步沉淀蛋白质。取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，组弗氏柠檬酸杆菌基因组弗氏柠檬酸杆菌基因组分析讨论及注意事项当太多，胶染色过深,带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，分钟后再观察。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害。异戊醇其蒸气或雾对眼睛皮肤粘膜和呼吸道有刺激作用实验中，试剂的配制是重要的，如果试剂出现，下面的操作就没有意义了。在配制试剂时，所有的称量要准确。电子天平都要预热后才可以进行使用。配制试剂时，不可照书加试剂，例如在配制缓冲液的需要严格控制的试剂