菌水 制成孢子悬液，加入经灭菌处理的沙和土的混合物或纯沙亦可作为载体，减 压抽去水分，这些吸附有孢子的干燥沙土载体，在低温下保存。 操作步骤斜面孢子先加灭菌蒸馏水，沿斜面轻刮孢子后，再吸 到灭菌备用的沙土管中，在真空度以下进行干燥，直至沙土 管外貌呈松散状态，然后低温保存。经真空干燥后的沙土管，最好放在 密闭容器内，容器内可放入吸潮剂或硅胶等，保藏期间整个容器置于冰箱年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 内。般保存期为年左右。 培养基的配制 培养基的类型 培养基的种类很多，可以根据组成状态和用途等进行分类，按照用途可以 分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢 子,种子和发酵培养基这三种类型。 孢子培养基 孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这 类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起 菌体变异。对孢子培养基的要求营养不要太丰富所用无机盐的浓度要适 量注意培养基的和湿度。 中性淀粉酶的孢子培养基配置如下将麸皮豆饼粉蛋白胨 琼脂制成斜面培养基，在蒸汽灭菌。 种子培养基 种子培养基是供孢子发芽生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成 为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的 含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和 繁殖。 中性淀粉酶的种子培养基的配置将豆饼蛋白胨和酵母膏各氯 化钠配置成种子培养基，在蒸汽灭菌。 发酵培养基 发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求， 使菌种迅速生长健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能 力，但要注意成本和能耗。 中性淀粉 生物制品药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法 有辐射灭菌化学灭菌加热灭菌静电除菌过滤介质除菌等。 过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤 器超细玻璃纤维纸石棉滤板金属烧结管等。 过滤除菌流程及设备 流程如下采风塔空气粗过滤器空气压缩机储气罐冷却器旋风分 离器冷却器丝网除沫器空气加热器总空气过滤器。 设备如下 采风塔采风塔建在工厂的上风头，高至少,气流速度。 粗过滤器主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起 定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。 空气压缩机作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。 空气储罐作用是消除压缩空气的脉动。 要求 其中，为罐高 为罐直径 为空压机每分钟排气量，状况下。 旋风分离器是利用离心力进行气固或气液沉降分离的设备。作用是分 离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。 冷却器空压机出口温度气温在左右，必须冷却。另外在潮湿的地 域和季节还可以达到降湿的目的。 丝网除沫器可以除去空气中绝大多数的以上的液滴和以上 的雾滴，般采用规格为直径孔且高度为的不锈钢丝网。 空气加热器列管内走空气，管外走蒸汽。可将空气湿度由降低到 以下。 总过滤器填充物按下面顺序安装孔板铁丝网麻布活性炭麻布 棉花麻布铁丝网孔板。介质要紧密均匀，压紧致，上下棉花层厚度为 总过滤层厚度的，中间活性炭层为。年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 无菌空气的检查 现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法斜面培养法和双碟培养法。这 里采用斜面培养法来检查。具体方法如下 三角瓶内装斜面培养基，其组成为麦芽糖豆粕水解液 ， ，接种后置旋转式摇床亡，下培养左右备用。 发酵罐的灭菌 发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌，此处采用空罐灭菌。空罐灭菌 是将所有的通气口都稍微打开，然后通入热水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每个 菌落达到灭菌效果。具体方法是在灭菌分钟。 种子扩大培养 本发酵属于级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下 孢子锥形瓶种子罐种子罐发酵罐 孢子制备 将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形 瓶中，在静置培养天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。 种子制备 将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面马铃薯煎出汁加 ，琼脂培养天。然后接入到种子罐， 搅拌，通风培养小时。此时菌种进入对数生长期镜检细胞密集，粗壮 整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液,酶活， 再接种到发酵罐。 发酵罐培养 培养基的配制用麦芽糖液配置成含麦芽糖豆粕水解液 豆油 深井水，调至。 发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入种子培养成熟液。培养条件年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 为温度，罐压，风量为，后 ，培养时间为。 发酵罐的设计 发酵罐的结构 通用发酵罐的主要组成部件有 罐体是发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是防止液内中心产生漩 涡，般用块挡板。 搅拌装置主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮 式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为 传热装置有夹套，列管等，这里采用外夹套。 通气部分通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵 罐通风量为,至发酵结束通风量为。 分布器有单管式和环形管式。 消泡装置用于消除产生的泡沫，最简单实用的消泡装置是耙式消泡器， 直接装在搅拌轴上。 进出料口罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜 人孔手孔取样管等，用以观测和检修。 发酵罐的工艺尺寸 常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸标准化设计见附图 其几何尺寸比例如下 表示搅拌器挡数单位全部为 发酵罐大小用公称体积表示，∏ 其中发酵罐圆柱形筒身高度发酵罐内径罐顶到罐底的高度 搅拌器直径挡板宽度下搅拌器距罐底的距离搅拌器间距 底封头或顶封头高度 计算年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 已知年产量为吨，中性淀粉酶产量为,年有个工作日，发酵 周期为小时，即天，清理发酵罐天，对淀粉的转化率为，预处理收 率，提取率为，发酵罐个数为个，装料系数为，是公称容积， 指筒身容积与底封头容积之和，则 发酵罐体积为 由∏∏ 得 那么 液面高度 物料衡算 本系统采用个发酵罐，每个为，中性淀粉酶产量为,对 糖的转化率为，提取率为，装料系数为，则 每个发酵罐在个发酵周期中性淀粉酶产量为 那么个发酵罐年的总产量为 吨 故符合年产量为吨的生产要求。 年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 前言 淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶 催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专性，酶退浆的退 浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法碱法更柔软，且不损伤纤维。此类 酶广泛存在于动植物和微生物中，几乎所有动物植物和微生物都含有淀粉酶。 淀粉酶是研究较多生产最早产量最大和应用最广泛的类酶。特别是 世纪年代以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用， 它的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的以上， 销售金额占到。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有淀粉 酶淀粉酶葡萄糖淀粉酶脱支酶环糊精葡萄糖基转移酶等。 淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之，并且大量的微生物可以用以 高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌 中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通 白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，淀粉酶在制药方面的重要性日 益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍然 是最大的。 中性淀粉酶是目前使用最广泛的种酶，主要运用于发酵食品医药纺 织及造纸工业。就我国而言般采用液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤 困难，使其发展受到了较大的限制。 本课题中以枯草杆菌为实验菌株，采用液体摇瓶发酵，并在培养基中添加发 酵助剂如和等来提高酶活。 枯草芽孢杆菌可利用蛋白质多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。 有的菌株是淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身 合成淀粉酶蛋白酶脂肪酶纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物 体内的消化酶类同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有 机物中，易在枯草浸汁中繁殖。 年产吨中性淀粉酶发酵工艺设计 第页 菌种的选育 菌种的选育及制备 微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重 要，我们此次设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶的整体过程。 选择性分离的步骤般是 含微生物材料采集标本材料的预处理菌种的分离富集培养 菌种初选菌种复选性能鉴定菌种保藏。 含微生物材料的选择 土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物 常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性 的土壤。采土时先用小铲除去表土，取㎝深处的土样，选好点，每 点取土混在起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间地点植被等情况。 预处理 在培养过程中以淀粉作为唯或主要碳源，控制在。那些在所 采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板 上分离到产生中性淀粉酶的菌株。 所需菌种的纯化和分离 可用平板划线法进行菌种分离。方法如下用接种管蘸取少量经增殖培养后 的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻 划线，划线时平板面与接种环成，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线， 线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板 内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐 分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯 草芽孢杆菌野生菌株。 菌株的培养 常用培养基配方蒸馏水蛋白胨牛肉膏琼脂。 本课题以麸皮豆饼粉作为天然培养基，在保温箱