医学硕士论文--产气肠杆菌耐药特性及其质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究

温州医学院硕士学位论文用力震荡，离心吸弃上层小心吸取，不要破坏中层加，混合均匀，离心吸弃上层，将底层液体转到膜上，置新的的管上，离心去掉，加至滤液中，混匀将滤液转移至，离心加入于中，离心用洗两次将置的管上，离心将置新的管上，加预热后洗脱效果更好于膜中央，室温静置离心，收集洗脱液，即为细菌基因组。

细菌电泳定量制备的琼脂糖凝胶上样随机挑取部分菌株进行估计，将的稀释倍后与上样缓冲液混匀，用加样枪加入凝胶样品孔中，分别取，的的加入其余样品孔中电泳后在紫外灯下观察并估约的浓度根据估计的浓度稀释至所需浓度，冰箱保存，以备作为的模板。

温州医学院硕士学位论文引物设计首先在的中查找基因的序列信息，然后利用软件，遵循引物设计原则，根据实验需要来设计引物，引物设计好后用验证其特异性，符合要求的引物由上海生工合成比较成熟的基因引物，和基因参照参考文献，用验证其特异性后由上海生工合成。

所用引物详见表和。

表基因所用引物列表表检测基因型所用引物列表基因型引物序列产物长度退火温度引物名称引物序列参考序列产物长度退火温度参考文献本研究本研究本研究温州医学院硕士学位论文检测基因与基因初筛基因与基因用反应体系表，初筛后耐药基因阳性菌株测序体系用反应体系表，反应循环参数设置如图和，每次扩增时加标本阳性对照试剂阴性对照作为质控。

表初筛体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计表测序体系温州医学院硕士学位论文各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计图基因反应循环参数注为反应条件中的退火温度。

图基因反应循环参数注为反应条件中的退火温度。

产物电泳检测用电子天平称取琼脂糖，量取，加入锥形瓶中，在微波炉中加热溶解直至溶液变清，制得的琼脂糖溶液待溶液冷却到左右，加入溴化乙锭，使其终浓度为，混匀温州医学院硕士学位论文将凝胶倒入凝胶槽中，放置梳子待凝胶完全凝固后，将凝胶槽放入盛有缓冲液的电泳槽中，缓缓垂直拔出梳子，凝胶应完全被缓冲液覆盖，般没过胶面约取扩增产物与上样缓冲液混匀，用加样枪依次加入凝胶样品孔中，以和为标准盖上电泳槽，接通电源，以的电压进行电泳电泳结束后，用全自动凝胶成像分析系统观察结果，拍照保存。

阳性产物测序与目的片段大小相符的阳性产物由北京华大基因公司纯化后进行正反向双向测序，测序结果先在本地数据库比对，然后再在中用进行比对分析。

比对有差异的序列用软件递交至。

质粒接合转移试验参照王明贵等的方法，以大肠埃希菌对叠氮化钠耐药为接合实验受体菌，基因阳性产气肠杆菌为供体菌。

方法为取对数生长期的供体菌及受体菌各加到新鲜液体培养基中过夜培养。

接合子以胰蛋白胨大豆琼脂平板筛选，根据供体菌及受体菌的药敏结果确定筛选平板中药物的浓度，针对不同供体菌选用不同的药物筛选，筛选平板中含叠氮化钠及复方新诺明甲氧苄啶磺胺甲噁唑，氯霉素庆大霉素头孢唑啉或四环素中的种，置孵育。

在筛选平板上生长的菌落同时接种至含及不含环丙沙星的平板上，以了解基因是否同时转移。

筛选成功的接合子用大肠显色培养基予以初步确认，为进步确证供体菌的喹诺酮类耐药基因和基因是否共同传递到受体株，提取接合子进行相对应耐药基因的扩增。

接合转移实验判断标准见表。

表接合转移实验判断标准接合转移实验供体菌受体菌接合子阳性不生长不生长生长阴性不生长不生长不生长失败供体菌或受体菌有种生长生长琼脂稀释法检测供体菌对喹诺酮类药物的值用推荐的琼脂稀释检测临床分离菌株对环丙沙星诺氟沙星左氧氟硕士学位论文论文题目产气肠杆菌耐药特性及其质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型科学型指导教师二年五月目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分肠杆菌属细菌临床感染及耐药性特性研究材料和方法结果分析与讨论第二部分产气肠杆菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因及其相关特性研究材料和方法结果分析与讨论小结正文参考文献附录致谢综述综述参考文献独创性声明温州医学院硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称质粒介导的喹诺酮类耐药喹诺酮类药物耐药决定区最低抑菌浓度敏感中介耐药聚合酶链反应三磷酸脱氧核苷环丙沙星左旋氧氟沙星诺氟沙星萘啶酸头孢曲松头孢他啶氨基酸超广谱内酰胺酶胰蛋白胨大豆琼脂温州医学院硕士学位论文产气肠杆菌耐药特性及其质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究摘要目的了解温州医学院附属第医院年年间临床分离肠杆菌属菌的分布情况及耐药特性，为临床抗菌药物选择提供依据。

研究年年不依赖耐药背景的产气肠杆菌临床连续分离株中质粒介导喹诺酮类耐药基因的分布和特性。

研究质粒介导的喹诺酮类耐药基因与携带率的相关性，并分析其与不同抗菌药物耐药性的关系。

方法回顾性调查年年间临床分离肠杆菌属细菌的临床感染分布特点，分析肠杆菌属细菌的耐药性及变迁情况。

筛选产气肠杆菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因及基因，阳性产物进行测序以确定基因型。

选取株基因阳性菌株进行接合转移试验，以探讨质粒介导的喹诺酮类耐药基因的转移性，验证接合子的耐药基因，法测受体菌接合子琼脂稀释法检测供体菌，分析耐药基因与耐药性的关系。

结果本研究年间共收集肠杆菌属细菌株，其中以阴沟肠杆菌最多，含株，其次为产气肠杆菌株，聚团肠杆菌株，河生肠杆菌株，中间肠杆菌株。

按标本来源分，以痰液标本最多，占，其次为尿液脓液血液和引流液等。

临床常用抗菌药物中，敏感性最好的为亚胺培南，株中仅有株耐药，敏感率达其次为左氧氟沙星敏感率和环丙沙星敏感率，耐药率最高的是氨苄西林，耐药率达其次是头孢曲松。

的总检出率高达，各年度检出率都维持在左右的高水平。

株产气肠杆菌中共检出株携带基因，其中有株同时携带两种以上基因。

基因阳性菌株株，共株，温州医学院硕士学位论文共株，共株，经比对分析，基因型包括和测得的序列与中已登录的基因家族序列同源，未见突变株。

未检出基因。

株产气肠杆菌中，基因阳性菌株为株，阳性率为，对阳性菌株进行测序比对，其中株为，株为的变异株，变异株为第位氨基酸与第位氨基酸的突变。

其余株均为野生型。

本研究株产气肠杆菌中未检出基因。

株基因阳性菌株中有株同时携带基因，而株基因阴性菌株中仅株携带基因，两者存在显著性差异。

基因阳性和阴性株细菌对喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药率无统计学差异，对三代头孢菌素耐药率和阳性率存在显著性差异。

株基因阳性菌株中，接合转移试验成功株，接合子对多种抗菌药物的有不同程度的提升。

特异性证实接合子和供体菌具有相同的耐药基因。

结论临床分离肠杆菌属细菌耐药严重，对多种临床常用抗菌药物的不敏感率在以上，对亚胺培南敏感性最高，环丙沙星，左氧氟沙星的敏感性也较高，可作为临床肠杆菌属细菌感染的首选。

我院产气肠杆菌基因以基因为主，其次为基因，基因中以为主，基因亚型包括，未检出基因。

本研究以不考虑耐药背景的产气肠杆菌为研究对象，系统的检测基因，在国内首次报道在产气肠杆菌中检出和基因，并证实基因在喹诺酮类耐药和敏感菌株中均存在，喹诺酮类药物敏感菌株中基因的检出值得关注。

基因阳性菌株与基因阴性菌株基因携带率有显著性差异，可能有协同耐药机制存在，有待进步研究。

关键词肠杆菌属产气肠杆菌耐药性喹诺酮类质粒连续分离菌株温州医学院硕士学位论文，。

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