增速度与其接种密度也有关,般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制,或细胞释放到培养基中的因子影响了的生长细胞因子些细胞因子对于维持增殖和未分化状态亦十分重要。因此本实验采用该法进行间充质干细胞的分离培养方法。实验材料和实验器材实验动物成年大鼠，雌雄不限，重量左右，由山东中医药大学购买。主要实验仪器及试剂型培养箱美国倒置相差显微镜日本，培养基和培养基美国，胎牛血清抗州四季青生物工程有限公司，胰蛋白酶美国公司正常山羊封闭血清武汉博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶，北京中山试剂公司，兔抗大鼠神经丝蛋白，北京中山试剂公司，兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白，北京中山试剂公司，羊抗兔二抗北京中杉金桥试剂公司，碱性成纤维生长因子，美国公司，酶联免疫检测仪型公司，万瓶的青霉素和万瓶的链霉素，巯基乙醇二甲基亚砜等。实验方法间充质干细胞的分离培养基的制备培养基将干粉型培养基溶于总量的三蒸水中，再用水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。搅拌使其溶解,补加，以便调节值。将青霉素为万瓶的青霉素，溶解在体积内，每培养液中加，即成最终浓度为。将万瓶的链霉素，溶解到体积内，也是每加，使其最终浓度为。调节培养液的值为。毫升容量瓶定容。过滤法除菌。分装于玻璃瓶中，加入和胎牛血清约。同时按上面方法配置培养基。与培养基共同放置于冰箱保存备用。干细胞分离取周龄大鼠只，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用医用剪刀剪去骨两端，剔除附着于骨头上的肌肉等软组织，用含胎牛血清的培养基反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲洗入培养瓶中，直至髓腔发白，将获得的冲洗液充分吹打均匀，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置培养箱内静置培养。原代培养培养开始后后半量换液，后全量换液，以后每三天换液次。待细胞生长接近融合约培养时，加入胰蛋白酶消化分钟，倒置相差显微镜下控制消化，当细胞回缩变圆间隙增大时，立即加入含胎牛血清的培养液，终止消化。般，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量的新培养液，继续培养后换液，每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞增殖到覆盖培养瓶底的时，以胰酶进行消化，以的密度进行传代培养。传代培养倒掉培养瓶内旧培养液。向瓶内加入胰蛋白酶液和混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。置孵箱或室温温度下进行消化，后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩细胞间隙增大后，应立即中止消化吹打细胞使其分散成单个细胞，调整细胞浓度，按照传代培养，每换液次，传代细胞于内贴壁，呈梭形。传代时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞单核细胞易脱落的特点，保证在短时间内与瓶底分开，而淋巴细胞单核细胞因贴壁较强仍贴附于培养瓶底，通过的这种贴壁生长特性，每次换液去除悬浮生长的造血细胞和其他的些细胞，从而使得得到很好的分离纯化。不同培养基的比较比较间充质干细胞在和不同培养基的生长情况。观察细胞贴壁时间，对数生长期的时间。实验结果接种后第三天细胞开始贴壁生长细胞变大变形形态不。有的呈梭形，多角形，有少量突起，有的呈圆形，对其换液，之后每天换液共换液次，此时细胞贴壁率大约左右开始传代培养刚传代的细胞呈圆形，完全贴壁，形态较均，呈长梭形或三角形，胞核圆而明显，呈漩涡样生长。这与其他干细胞和骨髓中其他种类的细胞有很大的不同。骨髓其他细胞大部分游离于培养液中，而间充质干细胞则贴于细胞培养瓶壁上这样换液后大多数其他细胞被除去，大量间充质干细胞则留于培养瓶中进步传代培养。传代细胞生长较快，般可达融合，本实验经分离纯化获得均生长的长梭形或多角形贴壁细胞便是间充质干细胞，但可见还有部分骨髓细胞残留，所以通过反复传代后贴壁细胞形态趋于均，且细胞表型更为纯化。如此多次传代后间充质干细胞基本达到实验要求。可方便观察和研究形态。因为间充质干细胞与其他干细胞和骨髓中其他种类的细胞在形态上有很大的不同。同时不同物种的体外培养的形态学特征大致相同。因此可很容易的从细胞培养集中找到间充质干细胞。通过观察细胞生长可以发现也可以也可以很好的分离培养骨髓间充质干细胞，但是比较了下比细胞生长的更快，而且状态更好。结论骨髓中含有多种细胞，包括基质细胞，血管细胞，脂肪细胞，成骨细胞，破骨细胞，造血干细胞和间充质干细胞。以前认为骨髓中细胞的功能只是骨髓内细胞再生和再生循环血细胞。现在的研究揭示骨髓干细胞有分化成多种细胞的潜能。骨髓间充质干细胞体外分离培养后能向各种结缔组织和部综述的生物学特点骨髓问充质干细胞是类从骨髓中分离的具有强大增殖能力和多向分化能力的干细胞，后来有许多研究表明，骨髓以外的其他器官也广泛存在着具有多向分化潜能的干细胞，体内所有这类干细胞统称为问充质干细胞它在定条件下可分化为骨软骨脂肪肝神经心肌等多种组织细胞。体外培养的细胞体积较小，呈梭形，核浆比大，在培养体系中倍增时间约为小时。处于。期，非增殖状态的特异性表达鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。具有广泛的细胞因子表达谱，包括造血因子非造血生长因子白细胞介素趋化因子等，提示对维持骨髓微环境有重要作用。也表达多种生长因子和细胞因子受体以及细胞间黏附作用的受体，提示的功能受自分泌和旁分泌循环的调控。不仅参与诱导调节骨髓造血干细胞和基质细胞的发育，而且可以促进细胞外基质分子的有序排列。的分离方法全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于的贴壁生长，可采用和胎牛血清培养。对营养要求高，胎牛血清终浓度为，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对影响不大。细胞融合后以比例传代，天换液次离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释离心，采集交界处的单核细胞层，洗涤次后，加入培养液接种培养细胞表面分子标记分选法，主要是根据的细胞表面分子特征来分离。般采用流式细胞仪免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到特异性的细胞表面标记物该法较少采用。影响扩增的主要因素血清血清对大量扩增起着重要的作用，不同浓度的血清对培养纯度的影响亦较大，常用的胎牛血清培养接种密度的体外扩增速度与其接种密度也有关，般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了的生长细胞因子些细胞因子对于维持增殖和未分化状态亦十分重要动物种属般认为的生长特性相似，但也有资料显示生长特点有种属差异。大鼠的原代提取扩增和纯化取周龄大鼠只，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，剔除附着于骨头上的肌肉等软组织，以液反复冲洗骨髓腔，直至髓腔发白，将获得的冲洗液充分吹打均匀，以目筛网过滤，获得单细胞悬液，将此单细胞悬液转移到离心管中，以，离心，吸除上清液，将获得的细胞再次以液重悬后，接种于塑料培养瓶中。后首次换液，以后每隔两三天换液次，培养体系为体积分数为胎牛血清。每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞增殖到覆盖培养瓶底的时，以胰酶进行消化，以的密度进行传代培养。存在问题和展望尽管近年来对骨髓的研究取得了很大进展，但仍然存在下列问题有待解决骨髓间充质干细胞缺少特异性表面标志物，对其鉴定困难，只能结合其形态和部分表面标志物进行综合判断。目前对于干细胞也仅限于功能上的定义，而没有足够的形态学和表型上存在的证据。因此在分离提取间充质干细胞时，由于对于细胞的特性尚缺乏足够的了解，使分离方法几乎不可能达到完全纯化培养过程中的异质性，影响了干细胞分离纯化的效果。长期培养发现，多次传代后，并不能保留其分化能力。对于传代后分化能力丧失的原因，近来有人认为与端粒酶缺失有关，依据是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓，即使是早期的也不能分化为软骨细胞和脂肪细胞。易于外源基因的转染和表达，在细胞治疗和基因治疗中也有着广泛的应用，但骨髓中含量很少，每个单核细胞中大约有个，难以满足组织工程和细胞治疗的需要，因此体外纯化和扩增尤其重要。本实验体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，观察其增殖和生长特性，并探讨人重组表皮生长因子，对其体外增殖的影响。尽管对间充质干细胞的特性还有很多未知，但由于具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞。同时，在临床应用上有很高的潜力，特别是在组织与细胞移植方面有很高的应用价值把运用于临床疾病的治疗，比如心血管疾病血液系统疾病神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。在这些领域的研究中有很多已经获得成功，因此有着广阔的临床应用前景。迄今在的研究还存在许多问题和争议，也显示出好的预兆和前景。人们将在不远的将来定会阐明其多向分化潜能的本质，并掌握其规律，使更好地造福人类。参考文献，刘瑶瑶，陶玉香,徐海伟,骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展西部医学舒胜文，李盛琳，马绪臣大自鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究现代口腔医学杂志刘瑶瑶，陶玉香骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展西部医学,博杰，蒋迎九，姜蓉。骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定王宇，魏书艳，史小琴，王燕，张明艳。许文杰大鼠骨髓问充质干细胞的分离培养及对其增殖的影响细胞与分子免疫学杂志，王廷华，羊惠君干细胞理论与技术北京科学出版社，世纪生物技术丛书，刘瑶瑶，陶玉香。骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展西部医学博杰，蒋迎九，姜蓉。骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定,全仁夫。汤样华，黄忠名等兔骨髓闾充质干细胞的分离培养及诱导分化中医正骨，月第卷第期周丽娜谢华。改良法体外分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞实验研究解剖学研究致谢四年时光就这样匆匆走到了尽头，回首其间的日日夜夜，心中有百般滋味萦绕，在学习中不仅学到了重要的学术知识同时学到了很多做人的道理。在短暂的四年中得到了许许多多难以忘怀的善意帮助，因此在这即将离开的时刻我内心满怀的感激和敬意。感谢我的导师杨晓云副教授在我课题的研究设计资料的收集分析及论文的构思撰写等方面倾注的大量心血。正是杨老师的循循善诱悉