年生产15000吨基因重组纤维素酶系列生产品项目立项投资计划报告书.doc_中文版高速下载

在满足生产工艺同时严格执行国家现行的有关规范标准，并充分考虑与周围 建筑的协调，力求建成个环境优美组分的表达调控是个非常复杂的过程，其中具有关键的作用。

据报道 ，当基因缺失时，会影响纤维素酶系其它酶的表达，而缺失，等基因时， 只件进行了摸索，尝试进行液体培养基深层发酵，通过分段控制 值温度和溶解氧进行发酵，发酵小时左右酶活达到最高，为工业化大规模生产纤维素酶提供了参考。

技术研制报告 纤维素酶属诱导型酶类其多个酶在大肠杆菌中得到表达。

但是这体系表达率低，产生的酶多数不能 分泌到胞外。

本项目成果使纤维素酶在原木霉宿主菌中获得稳定高效表达，可以用于大规模培养及工业化生产。

本项目对基因工程菌株的培养及产酶条的真核启动子，使不再受到培养基中葡萄糖 影响，获得高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。

几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已下，同源重组技术可对宿主细胞 染色体基因进行精细的改造 同源重组后被击中的基因或新引入的基因随染色体的复制而稳定复制。

技术特点或创新点 本项目由于在上游加入不受葡萄糖抑制类能按设计对极其复杂的细胞基因组结构进行定点定量的改变，从而定向的改变细胞的遗传结构和 特征。

同源重组技术的特点为 同源重组技术能把外源基因引入染色体的特定片段上，在设计合理的情况 由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有结构被破坏，此即为基因破坏或剔除 靶基因的全部序列为新的基因所取代。

这新兴技术已被证明为目前能精确的修饰基因组的最有效方法，从理 论上讲它将使人，又称基因打靶，指外源与受体细胞 染色体上的同源序列之间发生重组并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。

根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的纤维的微结晶，利 于进步降解。

基因的同源重组技术 基因的同源重组技术作用顺序不是绝对按各酶的功能也不是简单固定的。

和都能引起纤维素的分 散和脱纤化，因此纤维素的结晶结构被打乱导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁 腔壁和微裂隙壁维寡糖和葡萄糖。

其催化机理与溶菌酶相似，糖苷配基的脱去涉及 个保守羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂执行酸碱催化的双置换反应谷氨酸位于细菌和真菌，及葡 萄糖苷酶的活性位点。

协同作用其素易于水化之后内切酶作用于经外切活化的纤维素，分解 其，键，产生纤维二糖三糖等短链低聚糖。

在内切葡聚糖酶外切葡聚糖酶和，葡萄糖苷酶的协同作 用下，纤维素的，糖苷键逐步水解，形成纤用。

纤维素降解过程首先被外切纤维素酶的 吸附到不溶性纤维素表面，使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离从而为纤维素水解酶类的作用提高了可及性和反应性，从而使纤维生产工艺条件致，那 么，所生产出来的产品性能将优于中试。

技术或工艺特点以及与现有技术或工艺比较所具有的优势 技术原理 纤维素酶 自然界中纤维素的降解需要内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作后即可投入生产。

必要的说明。

纤维素酶工程菌株的构建采用的是国际前沿的生物工程技术及基因打靶技术，但是，酶制剂生 产工艺是公知技术。

此外，生产过程的发酵条件优于实验室条件，因此，只要中试设定条件与年以上纤维素酶生产经验，已经掌握了成熟的纤维素酶生产工艺，因此，可以实现产业化生产。

公司专家已经设计了纤维素酶系列产品生产线，主体设备及内部构件和管路连接已经完成。

配套设备及 装饰工程完工产样品已交付用户使用，用户已出具使用报告详见宁夏夏盛果汁果酒酶有限公司传真 函。

科大公司技术专家已经针对基因重组纤维素酶生产工艺条件开发了连续发酵等生产工艺。

此外，公司技术专 家有十年产样品已交付用户使用，用户已出具使用报告详见宁夏夏盛果汁果酒酶有限公司传真 函。

科大公司技术专家已经针对基因重组纤维素酶生产工艺条件开发了连续发酵等生产工艺。

此外，公司技术专 家有十年以上纤维素酶生产经验，已经掌握了成熟的纤维素酶生产工艺，因此，可以实现产业化生产。

公司专家已经设计了纤维素酶系列产品生产线，主体设备及内部构件和管路连接已经完成。

配套设备及 装饰工程完工后即可投入生产。

必要的说明。

纤维素酶工程菌株的构建采用的是国际前沿的生物工程技术及基因打靶技术，但是，酶制剂生 产工艺是公知技术。

此外，生产过程的发酵条件优于实验室条件，因此，只要中试设定条件与生产工艺条件致，那 么，所生产出来的产品性能将优于中试。

技术或工艺特点以及与现有技术或工艺比较所具有的优势 技术原理 纤维素酶 自然界中纤维素的降解需要内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。

纤维素降解过程首先被外切纤维素酶的 吸附到不溶性纤维素表面，使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离从而为纤维素水解酶类的作用提高了可及性和反应性，从而使纤维素易于水化之后内切酶作用于经外切活化的纤维素，分解 其，键，产生纤维二糖三糖等短链低聚糖。

在内切葡聚糖酶外切葡聚糖酶和，葡萄糖苷酶的协同作 用下，纤维素的，糖苷键逐步水解，形成纤维寡糖和葡萄糖。

其催化机理与溶菌酶相似，糖苷配基的脱去涉及 个保守羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂执行酸碱催化的双置换反应谷氨酸位于细菌和真菌，及葡 萄糖苷酶的活性位点。

协同作用其作用顺序不是绝对按各酶的功能也不是简单固定的。

和都能引起纤维素的分 散和脱纤化，因此纤维素的结晶结构被打乱导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁 腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的纤维的微结晶，利 于进步降解。

基因的同源重组技术 基因的同源重组技术，又称基因打靶，指外源与受体细胞 染色体上的同源序列之间发生重组并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。

根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型 由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有结构被破坏，此即为基因破坏或剔除 靶基因的全部序列为新的基因所取代。

这新兴技术已被证明为目前能精确的修饰基因组的最有效方法，从理 论上讲它将使人类能按设计对极其复杂的细胞基因组结构进行定点定量的改变，从而定向的改变细胞的遗传结构和 特征。

同源重组技术的特点为 同源重组技术能把外源基因引入染色体的特定片段上，在设计合理的情况下，同源重组技术可对宿主细胞 染色体基因进行精细的改造 同源重组后被击中的基因或新引入的基因随染色体的复制而稳定复制。

技术特点或创新点 本项目由于在上游加入不受葡萄糖抑制的真核启动子，使不再受到培养基中葡萄糖 影响，获得高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。

几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中得到表达。

但是这体系表达率低，产生的酶多数不能 分泌到胞外。

本项目成果使纤维素酶在原木霉宿主菌中获得稳定高效表达，可以用于大规模培养及工业化生产。

本项目对基因工程菌株的培养及产酶条件进行了摸索，尝试进行液体培养基深层发酵，通过分段控制 值温度和溶解氧进行发酵，发酵小时左右酶活达到最高，为工业化大规模生产纤维素酶提供了参考。

技术研制报告 纤维素酶属诱导型酶类其多个酶组分的表达调控是个非常复杂的过程，其中具有关键的作用。

据报道 ，当基因缺失时，会影响纤维素酶系其它酶的表达，而缺失，等基因时， 只影响自身的表达。

另有研究表明是木霉纤维素酶系统中最先表达的酶，其产物进步诱导纤维素酶其他酶 如，等酶基因的表达。

而基因的表达又受到葡萄糖的抑制因此要提高木霉的纤维素酶的产酶能力就可以通过木霉基因克隆，将其构建在不受葡萄糖抑制的真核启动子下游如， 等启动子，使不再受到培养基中葡萄糖影响而得到高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达， 较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。

由于木霉菌属于半知菌，缺乏有性阶段，对其杂交育种有定困难。

原生质体育种是种非常有效的方法，木霉 的转化系统与其他真菌转化系统相似，多为使用细菌来源的质粒构建的载体，在聚乙二醇，山梨醇和氯化钙作 用下把目的基因或片段引入受体原生质体，经过再生和选择获得转化子。

选用个稳定的选择标记对建立木霉转 化系统是非常必要的，木霉转化的选择标记包括营养缺陷型标记和显性标记两类。

前者常用的如或，后 者常用的有和。

本成果采用先进的分子生物学技术，构建成功高活力纤维素酶工程菌体，超过国内目前使用的生产菌体的产酶能 力，达到了国际先进水平。

供试菌种绿色木霉中国科学技术大学生命科学学院基因工程实验室保藏。

启动子选择。

载体中国科学技