缓冲液，等不含该基因位于约的质粒上此株细菌同时携带和型碳青霉烯酶基因。关键词鲍曼不动杆菌耐药性内酰胺酶基因型温州医学院硕士学位论文类耐药的鲍曼不动杆菌中，株携带型内酰胺酶基因，占，说明产型内酰胺酶是本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。株携带基因的鲍曼不动杆菌，质粒定位试验表明散，等基因都有检出基因型以为主，也都有检出。鲍曼不动杆菌阳性基因大多数位于质粒上。株对碳青霉烯高，对大多数抗菌药物尤其内酰胺类呈现较高的耐药性，且耐药性有明显上升趋势，耐药现象严重。温州医学院硕士学位论文株鲍曼不动杆菌基因型以为主，通过可知，其流行的主要形式为克隆播外神外烧伤创伤观察室和呼吸内科，提示同克隆株在相同病区和不同病区之间均存在不同程度的克隆播散，说明本院型流行株克隆播散现象严重。结论所测株鲍曼不动杆菌仅对少数抗菌药物敏感性稍阳性菌株提取质粒扩增，发现所有基因均位于质粒上。通过分析，株型阳性的鲍曼不动杆菌中，共分成个克隆。其中有株属于克隆，主要分布在监护病房，其他病区包括脑基因进行测序，经比对，基因型为检出阳性株，占另外，本研究发现株携带基因的鲍曼不动杆菌。阳性菌株接合转移试验均未见接合子生长，接合试验阴性。对部分基因进行测序，经比对，基因型为检出阳性株，占另外，本研究发现株携带基因的鲍曼不动杆菌。阳性菌株接合转移试验均未见接合子生长，接合试验阴性。对部分阳性菌株提取质粒扩增，发现所有基因均位于质粒上。通过分析，株型阳性的鲍曼不动杆菌中，共分成个克隆。其中有株属于克隆，主要分布在监护病房，其他病区包括脑外神外烧伤创伤观察室和呼吸内科，提示同克隆株在相同病区和不同病区之间均存在不同程度的克隆播散，说明本院型流行株克隆播散现象严重。结论所测株鲍曼不动杆菌仅对少数抗菌药物敏感性稍高，对大多数抗菌药物尤其内酰胺类呈现较高的耐药性，且耐药性有明显上升趋势，耐药现象严重。温州医学院硕士学位论文株鲍曼不动杆菌基因型以为主，通过可知，其流行的主要形式为克隆播散，等基因都有检出基因型以为主，也都有检出。鲍曼不动杆菌阳性基因大多数位于质粒上。株对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌中，株携带型内酰胺酶基因，占，说明产型内酰胺酶是本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。株携带基因的鲍曼不动杆菌，质粒定位试验表明该基因位于约的质粒上此株细菌同时携带和型碳青霉烯酶基因。关键词鲍曼不动杆菌耐药性内酰胺酶基因型温州医学院硕士学位论文，温州医学院硕士学位论文，酵母提取物和氯化钠于烧杯中，加入约的去离子水，搅拌使充分溶解，用调值至，定容至，灭菌后于冰箱保存。冰乙酸以蒸馏水充分溶解，调节为，定容到，存于冰箱，使用时稀释倍。溴化乙锭在水中加入溴化乙锭，确保溶解，室温避光保存。上样缓冲液溴酚兰蔗糖加蒸馏水至，充分搅拌混匀。硼酸，或者粉末蒸馏水去氧胆酸十二烷基肌氨酸钠蒸馏水蒸馏水裂解液温州医学院硕士学位论文方法内酰胺酶基因检测采用法扩增内酰胺酶编码基因，包括碳青霉烯酶。采用煮沸法提取细菌基因组将血平板上过夜培养的单个菌落挑于含的管中过夜培养，然后于沸水中煮离心，上清液作为模板。各基因的扩增引物序列见表。表内酰胺酶基因的引物序列基因名称引物序列产物长度退火温度反应初筛每反应体系引物均为，温州医学院硕士学位论文，倍缓冲液，等不含，超纯水，模板液，总反应体积，见表。表初筛体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计反应测序每反应体系引物均为倍缓冲液，等不含，超纯水，模板液，总反应体积，见表。表测序体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计反应参数如下预变性，变性，退火，温州医学院硕士学位论文延伸，共循环次，最终延伸，最后保存。产物电泳检测用电子天平称取琼脂糖，量取，加入锥形瓶中，在微波炉中加热溶解直至溶液变清，制得的琼脂糖溶液待溶液冷却到左右，加入溴化乙锭，使其终浓度为，混匀将凝胶倒入凝胶槽中，放置梳子待凝胶完全凝固后，将凝胶槽放入盛有缓冲液的电泳槽中，缓缓垂直拔出梳子，凝胶应完全被缓冲液覆盖，般没过胶面约取扩增产物与上样缓冲液混匀，用加样枪依次加入凝胶样品孔中，以为标准盖上电泳槽，接通电源，以的电压进行电泳电泳结束后，用全自动凝胶成像分析系统观察结果，拍照保存。阳性产物测序与目的片段大小相符的阳性产物由北京华大基因公司纯化后进行正反向双向测序，测序结果先在本地数据库比对，然后再在中用进行比对分析。接合转移试验参照等方法，分别以大肠埃希菌对叠氮化钠耐药和大肠埃希菌对利福平耐药为接合实验受体菌，以基因阳性菌株为供体菌。方法为取对数生长期的供体菌及受体菌各加到新鲜液体培养基中过夜培养。接合子以胰蛋白胨大豆琼脂平板筛选，根据供体菌及受体菌的药敏结果确定筛选平板中药物的浓度，筛选平板中含叠氮化钠和含利福平头孢他啶，置孵育。接合转移实验判断标准见表。表接合转移实验判断标准接合转移实验供体菌受体菌接合子阳性不生长不生长生长阴性不生长不生长不生长失败供体菌或受体菌有种生长生长温州医学院硕士学位论文阳性基因质粒定位快速质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作步骤如下取过夜培养的菌液，加入离心管中离心分钟，尽量吸弃上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入已加入，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入，温和地上下颠倒混匀次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过分钟，以免质粒受损伤。向离心管中加入，立即温和地上下颠倒混匀次，此时出现白色絮状沉淀。，离心分钟，吸取上清，加入到已装入的中，注意不要吸出沉淀。，离心秒，倒掉中的废液，将放回中。向中加入已加入无水乙醇离心秒，倒掉中的废液，将重新放回收中。向中加入请先检查是否已加入无水乙醇离心分钟，倒掉中的废液，将重新放回收中。，离心分钟，倒掉废液。