表主要培养基和试剂的配方及配制方法培养基或试剂成分配方配制方法琼脂琼脂琼脂，蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。电泳缓冲液冰醋酸冰醋酸蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。温州医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶琼脂糖干粉琼脂糖干粉缓冲液琼脂糖干粉和缓冲液混匀后，微波炉高热加热至沸腾，取出摇晃，中低热再次加热至完全溶解，冷却至左右，加入左右的，混匀后缓慢倒入电泳模具中，自然凝固后使用。刚果红平板刚果红，胰蛋白胨克雷伯菌生物膜外排泵温州医科大学硕士学位论文的值的高低之间没有相关性，进步证明生物膜细菌对抗菌药物的高水平耐药不是通过生物膜的物理屏障作用阻止其渗透入细菌内部来产生的。外排泵基因是菌株体外生物膜形成的种机制。关键词肺炎，且不具有特定的流行分布特点。对试验菌株的生物膜的值相较于对应菌株的升高了倍，在定程度上解释了临床上发生的药物体外敏感而体内治疗无效的现象。的值的高低与细菌形成生物膜部分分离自痰液，且此类耐药菌株逐年增多。菌株形成生物膜的能力与碳青霉烯类耐药程度无相关性，不能认为单的生物膜屏障作用就能造成耐药性的增强。本研究还证明生物膜形成能力与多种毒力表型和基因型无关临床分离的肺炎克雷伯菌标本来源主要来自于痰液，主要分离的科室是，对多种药物耐药情况严重，仅对碳青霉烯类药物保持较好的敏感性。痰液标本分离的肺炎克雷伯菌体外形成生物膜的能力最强，同时我院大膜的值的水平低。细菌试验状态生物膜状态含浮游状态含生物膜状态下外排泵基因的表达量都比校准状态不含培养基的细菌浮游态温州医科大学硕士学位论文下高。结论本院的值比不含培养基培养的生物膜值都有不同幅度的提高，即亚抑菌浓度的对每株菌生物膜的形成能力都表现出不同程度的促进作用。另外，外排泵缺失的试验菌株比外排泵基因完整的试验菌株形成生物，都表现为耐药。但对细菌的值的大小与细菌形成生物膜的能力并没有相关性，即并不是生物膜的值越高，就越高。含亚抑菌浓度的培养基下培养的生物膜，编码菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并没有降低型别菌株生成生物膜的能力与其他型别相比无明显差异。对试验菌株的值范围为，都表现为敏感，而值的范围为形成能力与第部分试验中各类标本的总体水平无差异，中痰液标本生物膜形成能力与第部分试验获得的痰液标本之间也无差异具有超粘特性的菌株产纤维素的菌株形成生物膜的能力并不比表型试验阴性的菌株强菌株对碳青霉烯类药物亚胺培南美罗培南厄他培南中的种甚至是三种药物表现出不同程度的敏感性下降或者耐药。同时发现在近几年中呈现明显的上升趋势，且主要集中在痰液标本。而总体的生物膜氨基糖苷类药物的总体耐药水平较接近，处于之间仅对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性最好，总体耐药率仅为。体外生物膜形成能力的初步分析发现痰液标本来源的菌株形成生物膜的能力高于其他标本来源。株试验药率接近，对呋喃妥因的耐药率已高达，对包括头孢曲松头孢他啶在内的三代头孢菌素类甚至是酶抑制剂复合药物氨苄西林舒巴坦的耐药率也都在以上，仅对四代头孢菌素的头孢吡肟的敏感性较好对喹诺酮来药物和尿液占，创面占，其他标本如脓液引流液等共占病区分布主要以科室为主，占，其次为神经外科和脑外科，共占药物敏感性结果显示我院肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐量测定采用实时荧光定量的方法检测在细菌含不含浮游状态下含不含生物膜状态下的表达差异情况。结果株肺炎克雷伯菌主要分离自痰液，分离率为，其次为血液占，在中加入不同浓度梯度的，分析外排泵抑制剂对生物膜形成是否有抑制或者诱导促进的作用的方法检测外排泵基因的分布。温州医科大学硕士学位论文细菌不同状态下外排泵基因表达量在中加入不同浓度梯度的，分析外排泵抑制剂对生物膜形成是否有抑制或者诱导促进的作用的方法检测外排泵基因的分布。温州医科大学硕士学位论文细菌不同状态下外排泵基因表达量测定采用实时荧光定量的方法检测在细菌含不含浮游状态下含不含生物膜状态下的表达差异情况。结果株肺炎克雷伯菌主要分离自痰液，分离率为，其次为血液占，尿液占，创面占，其他标本如脓液引流液等共占病区分布主要以科室为主，占，其次为神经外科和脑外科，共占药物敏感性结果显示我院肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率接近，对呋喃妥因的耐药率已高达，对包括头孢曲松头孢他啶在内的三代头孢菌素类甚至是酶抑制剂复合药物氨苄西林舒巴坦的耐药率也都在以上，仅对四代头孢菌素的头孢吡肟的敏感性较好对喹诺酮来药物和氨基糖苷类药物的总体耐药水平较接近，处于之间仅对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性最好，总体耐药率仅为。体外生物膜形成能力的初步分析发现痰液标本来源的菌株形成生物膜的能力高于其他标本来源。株试验菌株对碳青霉烯类药物亚胺培南美罗培南厄他培南中的种甚至是三种药物表现出不同程度的敏感性下降或者耐药。同时发现在近几年中呈现明显的上升趋势，且主要集中在痰液标本。而总体的生物膜形成能力与第部分试验中各类标本的总体水平无差异，中痰液标本生物膜形成能力与第部分试验获得的痰液标本之间也无差异具有超粘特性的菌株产纤维素的菌株形成生物膜的能力并不比表型试验阴性的菌株强，编码菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并没有降低型别菌株生成生物膜的能力与其他型别相比无明显差异。对试验菌株的值范围为，都表现为敏感，而值的范围为，都表现为耐药。但对细菌的值的大小与细菌形成生物膜的能力并没有相关性，即并不是生物膜的值越高，就越高。含亚抑菌浓度的培养基下培养的生物膜的值比不含培养基培养的生物膜值都有不同幅度的提高，即亚抑菌浓度的对每株菌生物膜的形成能力都表现出不同程度的促进作用。另外，外排泵缺失的试验菌株比外排泵基因完整的试验菌株形成生物膜的值的水平低。细菌试验状态生物膜状态含浮游状态含生物膜状态下外排泵基因的表达量都比校准状态不含培养基的细菌浮游态温州医科大学硕士学位论文下高。结论本院临床分离的肺炎克雷伯菌标本来源主要来自于痰液，主要分离的科室是，对多种药物耐药情况严重，仅对碳青霉烯类药物保持较好的敏感性。痰液标本分离的肺炎克雷伯菌体外形成生物膜的能力最强，同时我院大部分分离自痰液，且此类耐药菌株逐年增多。菌株形成生物膜的能力与碳青霉烯类耐药程度无相关性，不能认为单的生物膜屏障作用就能造成耐药性的增强。本研究还证明生物膜形成能力与多种毒力表型和基因型无关，且不具有特定的流行分布特点。对试验菌株的生物膜的值相较于对应菌株的升高了倍，在定程度上解释了临床上发生的药物体外敏感而体内治疗无效的现象。的值的高低与细菌形成生物膜的值的高低之间没有相关性，进步证明生物膜细菌对抗菌药物的高水平耐药不是通过生物膜的物理屏障作用阻止其渗透入细菌内部来产生的。外排泵基因是菌株体外生物膜形成的种机制。关键词肺炎克雷伯菌生物膜外排泵温州医科大学硕士学位论文用提高细菌营养物质摄取率。有研究还认为胞外基质之间复杂的吸附和应答作用可以减弱多种药物通过生物膜的渗透性，从而降低生物膜细菌对抗菌药物的暴露率和敏感性，可见生物膜在细菌耐药机制中也发挥重要作用。而目前关于生物膜的研究主要局限在鲍曼不动杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌等，与肺炎克雷伯菌生物膜特性的相关研究资料较少。关于其他菌属的生物膜相关研究报道认为生物膜的形成能力与细菌分离的标本来源有定的相关性，本研究中也发现肺炎克雷伯菌痰液来源的标本形成生物膜的能力远远高于其他标本来源。进步查阅相关临床资料发现我院近的都分离自痰液，同时痰液标本形成生物膜的能力又是最强的，提示我们可能在形成生物膜机制上存在些特殊性，并且我们猜测其生物膜的形成与其耐药性有定的相关性。接下来的研究将从多个方面详细分析其体外形成生物膜的特点及相关机制，以期为临床上存在的些药物体外敏感而体内治疗失败的问题提供理论依据，进而指导临床更有效的使用抗菌药物。第二部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌生物膜形成能力相关特性研究通常同时对头孢菌素类喹诺酮类以及氨基糖苷类药物表现出耐药，具有多重耐药甚至是范耐药的表型，而目前国内外关于其的研究主要针对分子耐药机制，包括碳青霉烯酶外膜蛋白的突变会缺失外排泵表达量的增加等。我们知道细菌耐药性的产生往往是复杂的多种机制共同导致的，关于多重耐药的铜绿假单胞菌鲍曼不动杆菌以及金黄色葡萄球菌的研究均已涉及到生物膜形成能力的研究，肺炎克雷伯菌生物膜相关数据的缺乏促使我们进行本部分的研究。材料与方法材料实验菌株温州医科大学硕士学位论文研究菌株为第部分分析筛选的株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，药敏试验质控菌大肠埃希菌购自卫生部临检中心实验阳性对照为本实验室扩增阳性并测序确认后的保存菌株。抗菌药物亚胺培南厄他培南美罗培南，等抗菌药物标准品购自中国药品生物制品检定所。主要材料和试剂细菌提取试剂盒杭州昊天生物科技有限公司反应原料和大连有限公司引物合成及产物测序委托华大基因普通电泳琼脂糖干粉法国有限公司，琼脂英国有限公司核酸染料温州长风生物科技有限公司刚果红美国公司冰醋酸国药集团化学试剂有限公司。生物膜形成试验相关的试剂同第部分。主要仪器和设备聚合酶链反应仪仪凝胶电泳成像分析仪型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司型离心机，分光光度计美国有限公司全功能微孔板检测酶标仪美国公司径迹蚀刻膜美国公司。主要培养基和溶液的配制生理盐水甘油肉汤羊血琼脂培养基液体培养基的配制同第部分。表主要培养基和试剂的配方及配制方法培养基或试剂成分配方配制方法琼脂琼脂琼脂，蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。电泳缓冲液冰醋酸冰醋酸蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。温州医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶琼脂糖干粉琼脂糖