1、“.....与目前的检测 本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导等温扩增快 速检测病原菌技术。更为重要的 聚合酶用量浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验条件。 创新点 既往对病原菌的检测般采用细菌分离培养鉴定法，但该方 法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。近年 来，人们将技术用于病原菌的检测。技术虽然较传统方法灵敏 快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，方法容易产生非 特异性扩增产物，造成假阳性和假阴检测常见病原 菌方法的建立 常采用本实验室建立的基因组 快速提取技术提取致病菌。 扩增反应体系的优化对引物浓度内引物和外引物的最 佳浓度比模板浓度浓度聚合酶用量浓度等条 件进行优化。 ④温育条件的优化在之间优化等温扩增温度......”。

2、“.....水平。 二项目技术方案 技术方案 环介导等温扩增和多重等温扩增快速病原菌的检测。技术虽然较传统方法灵敏 快速，但需要较昂贵的仪器设备。方 法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。，能够获得最佳实验条件。 创新点 既往对病原菌的检测般采用细菌分离培养鉴定法，但该通过对引 物浓度内引这些引物的性能。本项目的另技术关键是最佳等温扩增体系优化。部分内容简介部分内容简介因组特点采用等温扩增软件设计了 部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。本项目的另技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过对引 物浓度内引物和外引物的最佳浓度比模板浓度浓度 聚合酶用量浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验条件......”。

3、“.....但该方 法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。近年 来，人们将技术用于病原菌的检测。技术虽然较传统方法灵敏 快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，方法容易产生非 特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响对样品的正确判断。 本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导等温扩增快 速检测病原菌技术。与目前的检测方法相比，等温扩增法具有快速 准确灵敏的特点。而且，等温扩增法是在恒温下进行，只需个简 单的恒温装置，不需要实验中的昂贵仪器，因而易于在基层食品 质量检测部门和医院推广使用。 目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒和 检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国内基本 上还未开展环介导的等温扩增研究工作......”。

4、“.....并对目前的等 温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌的多重等温扩 增技术，以克服当前个等温扩增反应只能检测种或的缺 点。因此，本项目的实施，将开发出具有自主知识产权的病原菌检测 试剂盒。 项目完成时达到的技术水平 项目完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术及 其配套试剂盒达到国际先进水平。 二项目技术方案 技术方案 环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测常见病原 菌方法的建立 常采用本实验室建立的基因组 快速提取技术提取致病菌。 扩增反应体系的优化对引物浓度内引物和外引物的最 佳浓度比模板浓度浓度聚合酶用量浓度等条 件进行优化。 ④温育条件的优化在之间优化等温扩增温度......”。

5、“..... 以上述研究结果为基础，建立常见病原菌的环介导等温扩增和 多重环介导等温扩增快速检测技术。 常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分析 将常见病原菌目标基因克隆至载体，转化后提取质粒， 倍比稀释成含目的基因拷贝数为，以其为模板 做环介导等温扩增反应，检测本方法的灵敏度。 常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析 分别以病原菌和非病原菌基因组为模板做环介导等温扩增反 应，检测本方法的特异性。常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准方法 及常规扩增方法比较分析 以的两个外引物做常规扩增，并与的扩增结果进 行比较分析，进步判断技术的灵敏度特异性和稳定性......”。

6、“.....分析本方法对不同 样品检测的准确率。 病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂盒的 研制 根据本项目所建立的最佳反应体系和反应产物显示方 法，研制开发快速检测病原菌的试剂盒包括单病原菌检测试剂盒 和多种病原菌同时检测试剂盒。 工艺流程 三项目技术质量指标 引物优化组合 反应体系的建立 灵敏度试验特异性试验反应条件优化阴性对照阳性对照 试剂盒 中试 同类产品比较试验国标法比较试验 方法应用于病原体检测 样品收集 核酸提取引物设计 基因序列分析本项目建立的方法对病原菌检测的准确率达到。 本项目建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到 拷贝......”。

7、“..... 对病原菌目的基因的等温扩增过程在分钟内完成，显 色法检测扩增产物在分钟内完成，电泳法检测扩增产物在分钟内 完成。 四项目执行过程中各阶段目标 年度 第季度设计引物，引物合成，购买实验菌株和有关试剂，完 善实验条件。 第二季度样品采集，病原菌提取。 第三季度等温扩增反应体系优化，温育条件优化。 第四季度扩增反应产物检测方法的建立快速显色法电泳分 析法。 年度 第季度环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确定， 选题的必要性 项目所处技术领域产业政策 本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目主 要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技 术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产权的 科研成果......”。

8、“.....市场竞争力强，项目完成后能够产生 较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业技术政策。 项目所处技术领域技术发展现状 目前的病原菌检测方法费时费力准确性低，开发快速准确 低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难题。 本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度高特异性的环 介导等温扩增技术开发出简便快速经济的检测试剂。 项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用 环介导等温扩增是利用个特殊设计的引物和具有链置换活性的 聚合酶，在恒温条件下特异高效快速地扩增的新技术。该 技术在内能扩增出靶序列拷贝。技术以其特异性强灵敏度高快速准确和操作简便等优点在核酸的科学研究疾病的诊断 和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用......”。

9、“..... 项目目前进展情况 课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研平 台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增 研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本项目的顺利完成奠定了 基础。 二技术方案论述 项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技术 水平 技术关键 本项目的技术关键之是引物设计。与常规引物不同， 环介导等温扩增引物设计难度大，组引物要求有个位点与靶序列 完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库中下载了 部分病原菌的基因组，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计了 部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。本项目的另技术关键是最佳等温扩增体系优化......”。