，中试结果与实验室试验结果致详见吉鉴定年限 本项目已完成基因重组纤维素酶工程菌株构建，该菌株现保存于吉林农业大学食品科学与工程学院实验室深 冻冰箱中。菌株及菌株构建技术的所有权详见附件技术合同。获得省长基金支持该项 目是地方农业产业化龙头项目，是国债资金重点支持的项目。 二项目技术基础 项目成果来源及知识产权情况 科大公司与中国科技大学易元生物技术有限公司合作，取得了基因重组纤维素酶原始菌株构建技术和菌株的 使用权详见附件专利的专有技术使用合同。 由科大公司提供原始菌株菌株构建技术及工艺方案，与吉林农业大学合作，取得了基因重组纤维素酶第二 代工程菌株及菌株构建技术的所有权详见附件技术合同。 已完成的研究开发工作及中试情况和 由科大公司提供原始菌株菌株构建技术及工艺方案，与吉林农业大学合作，取得了基因重组纤维素酶第二 代工程术基础 项目成果来源及知识产权情况 科大公司与中国科技大学易元生物技术有限公司合作，取得了基因获得省长基金支持该项 目是地方农业产业化龙头项目，是国债资金重点支持的项目。 二项目技号微生物技术 专项重点支持项目是国家科技部科技支撑计划生物技术产品中试与规模化生产配套技术 与国家高技术产业化专项总体思路原则目标等关联情况 该项目属于生物技术类，是国务院办公厅生物产业发展十五规划国办发部分内容简介部分内容简介品出口前景广阔。 与国家高技术产业化专项总体思路原则目标等关联情况 该项目属于生物技术类，是国务院办公厅生物产业发展十五规划国办发号微生物技术 专项重点支持项目是国家科技部科技支撑计划生物技术产品中试与规模化生产配套技术与工艺的研究与示范重 点支持项目该项目年已经列入吉林省科技发展计划，分别被评为重大和重点项目并获得省长基金支持该项 目是地方农业产业化龙头项目，是国债资金重点支持的项目。 二项目技术基础 项目成果来源及知识产权情况 科大公司与中国科技大学易元生物技术有限公司合作，取得了基因重组纤维素酶原始菌株构建技术和菌株的 使用权详见附件专利的专有技术使用合同。 由科大公司提供原始菌株菌株构建技术及工艺方案，与吉林农业大学合作，取得了基因重组纤维素酶第二 代工程菌株及菌株构建技术的所有权详见附件技术合同。 已完成的研究开发工作及中试情况和鉴定年限 本项目已完成基因重组纤维素酶工程菌株构建，该菌株现保存于吉林农业大学食品科学与工程学院实验室深 冻冰箱中。 年初已经在吉林农业大学完成了中试，中试结果与实验室试验结果致详见吉林农业大学生化实验室 检测报告。 中试及小规模生产样品已交付用户使用，用户已出具使用报告详见宁夏夏盛果汁果酒酶有限公司传真 函。 科大公司技术专家已经针对基因重组纤维素酶生产工艺条件开发了连续发酵等生产工艺。此外，公司技术专 家有十年以上纤维素酶生产经验，已经掌握了成熟的纤维素酶生产工艺，因此，可以实现产业化生产。 公司专家已经设计了纤维素酶系列产品生产线，主体设备及内部构件和管路连接已经完成。配套设备及 装饰工程完工后即可投入生产。 必要的说明。纤维素酶工程菌株的构建采用的是国际前沿的生物工程技术及基因打靶技术，但是，酶制剂生 产工艺是公知技术。此外，生产过程的发酵条件优于实验室条件，因此，只要中试设定条件与生产工艺条件致，那 么，所生产出来的产品性能将优于中试。 技术或工艺特点以及与现有技术或工艺比较所具有的优势 技术原理 纤维素酶 自然界中纤维素的降解需要内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。纤维素降解过程首先被外切纤维素酶的 吸附到不溶性纤维素表面，使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离从而为纤维素水解酶类的作用提高了可及性和反应性，从而使纤维素易于水化之后内切酶作用于经外切活化的纤维素，分解 其，键，产生纤维二糖三糖等短链低聚糖。在内切葡聚糖酶外切葡聚糖酶和，葡萄糖苷酶的协同作 用下，纤维素的，糖苷键逐步水解，形成纤维寡糖和葡萄糖。其催化机理与溶菌酶相似，糖苷配基的脱去涉及 个保守羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂执行酸碱催化的双置换反应谷氨酸位于细菌和真菌，及葡 萄糖苷酶的活性位点。协同作用其作用顺序不是绝对按各酶的功能也不是简单固定的。和都能引起纤维素的分 散和脱纤化，因此纤维素的结晶结构被打乱导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁 腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的纤维的微结晶，利 于进步降解。 基因的同源重组技术 基因的同源重组技术，又称基因打靶，指外源与受体细胞 染色体上的同源序列之间发生重组并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。 根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型 由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有结构被破坏，此即为基因破坏或剔除 靶基因的全部序列为新的基因所取代。这新兴技术已被证明为目前能精确的修饰基因组的最有效方法，从理 论上讲它将使人类能按设计对极其复杂的细胞基因组结构进行定点定量的改变，从而定向的改变细胞的遗传结构和 特征。 同源重组技术的特点为 同源重组技术能把外源基因引入染色体的特定片段上，在设计合理的情况下，同源重组技术可对宿主细胞 染色体基因进行精细的改造 同源重组后被击中的基因或新引入的基因随染色体的复制而稳定复制。 技术特点或创新点 本项目由于在上游加入不受葡萄糖抑制的真核启动子，使不再受到培养基中葡萄糖 影响，获得高效表达，从而促进其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。 几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中得到表达。但是这体系表达率低，产生的酶多数不能 分泌到胞外。本项目成果使纤维素酶在原木霉宿主菌中获得稳定高效表达，可以用于大规模培养及工业化生产。 本项目对基因工程菌株的培养及产酶条件进行了摸索，尝试进行液体培养基深层发酵，通过分段控制 值温度和溶解氧进行发酵，发酵小时左右酶活达到最高，为工业化大规模生产纤维素酶提供了参考。 技术研制报告 纤维素酶属诱导型酶类其多个酶组分的表达调控是个非常复杂的过程，其中具有关键的作用。据报道 ，当基因缺失时，会影响纤维素酶系其它酶的表达，而缺失，等基因时， 只影响自身的表达。另有研究表明是木霉纤维素酶系统中最先表达的酶，其产物进步诱导纤维素酶其他酶 如，等酶基因的表达。而基因的表达又受到葡萄糖的抑制因此要提高木霉的纤维素酶的产酶能力就可以通过木霉基因克隆，将其构建在不受葡萄糖抑制的真核启动子下游如， 等启动子，使 充分振荡后加入及氯化苄振荡混匀，保温，每隔振荡次 加入醋酸钠，离心，收集上清，用异丙醇沉淀得到总。 扩增序列 根据已知绿色木霉序列，设计引物，由上海生工公司合成 扩增用标准反应体系进行反应。 循环条件预变性，变性，复性，延伸，个循环后再延伸。 重组质粒载体的构建 用试剂盒从胶中回收产物，得到约的片段，将其用酶补平后回收 纯化。 将质粒载体在多克隆位点用限制性内切酶消化，产生的粘性突出末端用酶补平并将其 回收纯化，将上述两个片段以合适的比例建立反应体系，转化大肠杆菌，获得重组质粒载体。对筛选到 的重组质粒用内切酶和进行鉴定分析，所扩增的片段含有完整的序列。 重组质粒载体的构建 将质粒载体在用限制性内切酶消化，产生的粘性突出末端用酶补平并将其回收纯化，与片段以合适的比例建立反应体系，转化大肠杆菌，获得具有启动子的重组质粒载体。 重组质粒的转化及重组菌的筛选 将构建的重组质粒电转化宿主菌，利用显性标记进行初筛而后进步采用液体摇瓶培养检测发 酵液复筛，获得株表达量较高的重组菌，命名为。 液体培养基深层发酵 在的通气机械搅拌发酵罐中，接种量为，发酵过程采取分段控制值温度和溶解氧的工艺，发酵 左右酶活力最高，实验室样品酶活力达到液体。 技术的先进性 蛋白质基因同源重组技术是国家计划项目，计划项目在技术上均为国际领先或先进技术。基因重组纤维 素酶菌株构建是计划蛋白质基因重组技术的延续。本项目采用的基因打靶技术是国际先进技术，纤维素酶的技术 指标中热稳定性高于国外同类产品水平。 产品的技术性能生产成本销售价格优势 由于本项目在菌株改造上采用了世界先进的基因重组技术，所生产的纤维素酶在技术及其它方面具有以下优势 产品技术性能优势 第高活力。诺威信公司的同类产品酶活为，该公司产品的发酵液活力可达 第二热稳定性。美国杰能克公司产品的热稳定性在以下，该公司产品的热稳定性可达。 生产成本优势 据了解，国外厂家万活力纤维素酶生产成本在元吨以上，该公司的生产成本可控制在元吨以 下。 价格优势 国外同类产品市场售价为万元吨，可研及本报告中该公司产品出厂价为液态酶万元吨，固态酶 万元吨。 该重大关键技术的突破对行业技术进步的重要意义和作用 提高酶制剂行业整体水平。该项目是我国第个采用有自主知识产权的基因重组工程菌株进行产业化生产 的项目，对提升我国酶制剂行业总体水平，提高我国酶制剂行业和国外企业的竞争能力具有积极的意义。 基因重组纤维素酶菌株构建技术的成熟将对耐高温糖化酶菌株构建及其它酶制剂的基因重组具有借鉴意 义。 采用具有自主知识产权的工程菌株进行产业化生产将对我国酶制剂行业的自主创新具有积极的示范作用。 三项目建设方案 建设规模 根据吉林市的资源状况自然环境和市场调查情况，结合生产