1、，张用双蒸水浸湿的滤纸，先将硝酸纤维素膜在甲醛溶液中充分湿润，继而用双蒸水漂洗次，之后，将凝胶膜滤纸海绵放入盛着转移缓冲液的托盘里平衡分钟操作时应戴手套，用镊子小心轻夹硝酸纤维素膜的边缘，以防止将膜划伤或染上杂蛋白转移“三明治”的制作将转移夹取出，从负极按顺序平铺块海绵张滤纸凝胶张醋酸纤维素膜张滤纸块海绵，夹紧转移夹即制成需使用洁净的玻璃棒不断滚动以排除各层膜之间的气泡转膜使转移夹正极面朝电泳槽红色面置于电泳槽中，通电恒流转移分钟为避免转膜过程中体系温度过高，应将电泳转移槽置于冰上封闭及杂交封闭轻轻取出转膜结束后的凝胶和膜，剪除膜的角以作标记，可见膜上预染的条带，用将膜漂洗次，室温下置于丽春红染液中染色分钟，用双蒸水洗膜至水清且蛋白条带清楚，将膜置于封闭液中脱脂奶粉，常温摇床封闭分钟抗孵育用脱脂奶粉以。

2、高于假手术组，差异均具有统计学意义均干预组该蛋白的表达在相应时间点较生理盐水对照组有所增加均。法检测蛋白的表达蛋白表达的相对灰度值在假手术组生理盐水对照组亚组干预组亚组分别为，各组之间差异均有统计学意义均。结论大鼠脑缺血再灌注损伤溶酶体可能通过上调的表达参与细胞凋亡，该作用可能与信号通路相关。可通过抑制和的表达，减少神经功能缺损和脑梗死体积，发挥神经保护作用。关键词脑缺血再灌注凋亡溶酶体万方数据定小时，使脑组织变硬便于拍照计算梗死面积。将脑组织按顺序摆置后，数码照相机拍照，利用图像分析软件处理脑组织各层面总面积及白色梗死部位面积，计算相对梗死体积。相对梗死体积计算公式如下相对梗死体积梗死体积全脑体积各层面总梗死面积厚度全脑片总面积厚度各层面总梗死面积全脑片总面积注全脑体积指片大脑切片总体积之和蛋白质印。

3、混匀并煮沸万方数据加样浓缩胶完全聚合后，将胶架置入电泳槽内，将电泳缓冲液倒入电泳槽，当内槽电泳液低于外槽时，拔出梳子，用微量加样器将样品轻柔加入凝胶孔中，每加样次，用蒸馏水冲净加样器次，加样前应设置相应顺序电泳使电泳槽与电泳仪相接，预电泳时调整电压至恒压，检测分钟至溴酚蓝前沿到达分离胶，然后将电压调整至恒压，电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部注意不要让溴酚蓝跑出分离胶检测胶中蛋白将电泳后的块胶撤下，置入考马斯亮蓝溶液中注意勿将胶弄破，室温下摇床上染色分钟后倒去染色液先用双蒸水将剩余的染色液冲净，再加入盖过胶面的双蒸水，用微波炉煮至次，每次约分钟，若出现鲜明的蓝色蛋白条带，则认为电泳效果尚好转膜准备胶与膜取出电泳中另块胶，切除角作为标记，用双蒸水将凝胶漂洗次，每次分钟，准备张尺寸与凝胶相同的硝酸纤维素膜，块海。

4、溶酶体万方数据梗死体积，发挥神经保护作用。关键词脑缺血再灌注凋亡通路相关。法检测蛋白的表达蛋白表达的相对灰度值在假手术组生理盐水对照组亚组干预组亚组分别为，各组之间差异均有统计学意义均。结论大鼠脑缺血再灌注损伤溶酶体可能通过上调的表达参与细胞凋亡，该作用可能与信号通路相关。可通过抑制和的表达，减少神经功能缺损和脑梗死体积，发挥神经保护作用。关键词结论大鼠脑缺血再灌注损伤溶酶体可能通过上调的表达参与细胞凋亡，该作用可能与信号蛋白的表达蛋白表达的相对灰度值在假手术组生理盐水对照组亚组白的表达在相应时间点较生理盐水对照组有所增加均。法检测均干预组该蛋白的表达在相应时间点较生理盐水对照组均明显减少均。法检测蛋白的表达生理盐水对照组蛋白的表达在脑缺血再灌注后呈上升趋势，达到高峰，仍维持在较高水平，有所下降，但仍。

5、璃板装入玻璃板夹中，使两块玻璃板底部对齐卡到制胶架上配置分离胶根据待分离的蛋白质分子量选择分离胶浓度，然后按相应配方配置分离胶，在最后步骤中加入聚合片剂，立即混合均匀以减少气泡的产生灌注分离胶将混匀的分离胶沿玻璃板壁谨慎灌入两玻璃板之间直至梳子下约处，注意避免产生气泡及漏胶，完成后用蒸馏水淹盖胶层，以利丙烯酰胺的聚合，室温下放置约分钟至胶层与水层之间产生明显分界低温将影响丙烯酰胺的聚合，可使用恒温烘箱克服低温环境配置浓缩胶按照浓缩胶标准配方配置浓缩胶，同样注意避免气泡产生灌注浓缩胶分离胶发生聚合后，将上层水倒掉，并用滤纸洗净残余水份，将准备的浓缩胶沿玻璃板壁细致加在分离胶上直至短玻璃板顶端，插好梳子，避免气泡，室温下静置分钟至凝胶聚合电泳制备样品使每个样品的总蛋白含量相同，样品中加入同体积的上样缓冲液。

6、的比例稀释抗，把封闭好的硝酸纤维素膜放入杂交袋内，袋中加入配置好的抗溶液，用封口机封口万方数据后使与胶接触面朝上，过夜孵育后取出膜，用摇床洗膜次，每次分钟，除去残余的抗抗可回收再利用二抗孵育用脱脂奶粉以的比例稀释二抗，把封闭好的硝酸纤维素膜放入杂交袋内，袋中加入配置好的二抗溶液，严封杂交袋口，常温下摇床孵育小时，取出膜用摇床洗膜次，每次分钟曝光鉴定暗室准备暗室中在洁净盘内分别倒入显影液定影液和自来水备用曝光准备将张塑料膜放置在暗盒中，将硝酸纤维素膜移至塑料膜上，在离心管内加入发光液后均匀滴在硝酸纤维素膜上，将膜用另层塑料膜覆盖曝光暗室中准备张已裁剪至适当大小的光片，将胶片准确置于膜上，不能移动，关上暗盒后，曝光开始，可通过多次曝光提高效果，曝光完成后，取出胶片浸没于显影液中不断抖动使其显影，当胶片上出。

7、法检测目的蛋白的表达获取标本在假手术组生理盐水对照组干预组取相应组别大鼠，于缺血再灌注后相应时间点行水合氯醛腹腔注射至大鼠深度麻醉，快速断头后于分钟内迅速完成新鲜脑组织取材，并立即置于管内于超低温冰箱内冰冻保存，以防蛋白降解取材部位本实验选取的观察部位为缺血侧大脑皮层嗅球尖端以远，矢状裂至外侧裂上三分之的皮质区域，该部位的血液供应由大脑中动脉和大脑前动脉共同提供，为大鼠模型中具有细胞缺血损伤可逆性的脑缺血半暗带区之蛋白质印迹法详细步骤提取蛋白样本组织裂解方法自超低温冰箱中将待提取的蛋白组织标本取出，立即置于冰面上，以防蛋白质降解，用灭菌及预冷的眼科剪分离标本在冰面上称取组织置于玻璃匀浆器中，加入裂解液及适量溶液，匀浆充分至团块状组织消失使用移液器吸取匀浆液置于离心管中，将超声波细胞粉碎机功率调整为，使。

8、编号硕士学位论文大鼠脑缺血再灌注损伤介导的细胞凋亡与信号通路的关系研究生姓名蔡丽指导教师姓名职称张智博教授学科专业名称神经病学研究方向脑血管病年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人。

9、声探头浸于混悬液中，利用超声波粉碎次，每次持续秒，共分钟，以上操作均在冰面上进行下离心分钟，离心速度为万方数据在冰面上再次使用移液器吸取上清液置于新的离心管中，弃去下部沉淀物，此即为提取的蛋白液，放入超低温冰箱中保存备用法蛋白质定量取块酶标板，依次加入蛋白标准液与去离子水，每孔中蛋白标准液与去离子水的体积和为，根据样品实际数量，按每份试剂加份试剂配制工作液，混合充分后在酶标板各孔中各加入将酶标板置于振荡器上持续振荡秒，下放置分钟，然后在波长下检测其吸光值，横坐标为蛋白质含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线按照测得样品的吸光值，根据标准曲线查出相应的蛋白含量，除以样品稀释体积数后，乘以样品稀释倍数可得样品实际浓度凝胶的制备将的电泳玻璃板用自来水冲洗洁净后，再用蒸馏水继续冲洗次，晾干或烘干备用，将处理好的玻。

10、亡，认为是麻醉意外所致只大鼠在处死取脑时发现存在蛛网膜下腔出血只大鼠在处死取脑时发现存在脑出血只大鼠死亡原因未明。行为学评价假手术组的只大鼠麻醉苏醒后运动反应饮水进食等基本活动正常，未发现明显神经系统缺损症状体征，神经功能缺损程度评分均为分生理盐水对照组及干预组模型成功大鼠于麻醉苏醒后呈现反应迟缓精神萎靡减少或停止进食及饮水活动减少而喜蜷缩于饲养笼角等般情况较差的症状，检查时发现大鼠右侧前爪乏力而不能伸直抓握，提尾时右前爪屈曲贴于胸前，自由行走时向右侧转圈或右侧跌倒，右侧眼睑下垂征等神经系统缺损体征。生理盐水对照组及干预组模型成功动物行为学评分结果为分只分只分只，且相同时间点干预组的神经功能缺损评分均显著性低于生理盐水对照组均，提示的抑制剂能改善神经功能评分，具有神经保护功能。表，图万方数据分类号密级。

11、意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据中文摘要英文摘要论文正文第章前言第二章材料与方法第三章结果第四章讨论第五章结论参考文献附录文献综述成果致谢万方数据大鼠脑缺血再灌注损伤介导的细胞凋亡与信号通路的关系中文摘要目的本实验通过建立大鼠大脑中动脉闭。

12、明显条带后，再浸没于定影液中至胶片透明为止，将残余的定影液用自来水冲去，室温晾干保存扫描及分析扫描胶片，用图像分析软件检测目标条带光密度值即为目的蛋白相对含量。统计学分析采用软件包进行统计学处理，实验结果以均数标准差表示，应用单因素方差分析，组间比较应用检验。为差异具有统计学意义。万方数据第三章结果大鼠模型制作成功率本实验共使用只大鼠制作模型，其中只为假手术组，制备合格的大鼠模型为只，共只大鼠因各种原因致模型不符要求被淘汰，该试验模型成功率为。只大鼠被淘汰的原因如下只大鼠实验中线栓插入成功，但麻醉苏醒后未见神经功能缺损症状只大鼠实验中线栓插入成功且存活，但首次神经功能评分为分只大鼠在手术过程中出现出血过多而死亡只大鼠因拔线时致线栓完全拔出皮下血肿压迫气管而窒息死亡只大鼠于麻醉后出现呼吸费力，短时间内即。

参考资料：

[1]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号40（第21页，发表于2022-06-25）

[2]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号31（第21页，发表于2022-06-25）

[3]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号35（第21页，发表于2022-06-25）

[4]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号23（第21页，发表于2022-06-25）

[5]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号37（第21页，发表于2022-06-25）

[6]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号28（第21页，发表于2022-06-25）

[7]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号37（第21页，发表于2022-06-25）

[8]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号37（第21页，发表于2022-06-25）

[9]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号47（第21页，发表于2022-06-25）

[10]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号76（第21页，发表于2022-06-25）

[11]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号38（第23页，发表于2022-06-25）

[12]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号39（第23页，发表于2022-06-25）

[13]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号38（第23页，发表于2022-06-25）

[14]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号44（第23页，发表于2022-06-25）

[15]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号56（第23页，发表于2022-06-25）

[16]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号42（第23页，发表于2022-06-25）

[17]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号39（第23页，发表于2022-06-25）

[18]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号37（第23页，发表于2022-06-25）

[19]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号42（第23页，发表于2022-06-25）

[20]红色启航新时代党的组织路线党政党建PPT 编号33（第23页，发表于2022-06-25）