1、学位论文型高效液相色谱仪检测样品中腐胺精脒以及精胺的含量，检测波长均为，流动相为乙腈水。对样本进行检测时，于同波长下同时检测腐胺精脒精胺的含量，为内标化合物，出峰顺序为腐胺精脒己二胺精胺，出峰时间为。多胺浓度的计算通过标准曲线方程计算多胺含量。将高效液相色谱仪检测得到样品中腐胺精脒及精胺的峰面积分别与内标峰面积的比值代入各标准曲线方程，得到样品的质量浓度，结合蛋白定量结果计算腐胺精脒及精胺的含量。检。

2、出至细胞盒或液氮罐中。细胞计数细胞用胰酶消化，离心，弃上清，洗次，重悬细胞，取细胞悬液，加入台盼蓝染液，混匀后，取混合液至计数板，对计数板个大格小格的细胞进行计数。若细胞量较大可根据细胞量进行适当稀释。细胞浓度为个，个小格中细胞总个数，稀释倍数。质粒转染细胞细胞传代培养于培养皿后，待细胞融合至，将完全培养基更换为基础培养基。后，取基础培养基分别与脂质体和质粒混匀，静置。将含脂质体与含质粒的基础培养基。

3、待检测的细胞样本消化后收集，离心，弃上清，加入重悬细胞，离心，弃上清。加入细胞裂解液，冰上裂解，离心，将上清转移至管中。检测细胞中蛋白浓度。取细胞裂解液，加入内标化合物苯甲酰氯，涡旋振荡器振荡混匀后，恒温水浴箱水浴后，加入饱和氯化钠。在通风橱中，于苯甲酰化后的样品中加入乙醚，进行抽提，重复三次，将三次抽提液合并，在通风橱中待其挥发干燥。色谱级甲醇溶解沉淀后，以微孔滤膜过滤溶液，用万方数据三峡大学硕士。

4、万方数据三峡大学硕士学位论文,万方数据三峡大学硕士学位论文峡大学硕士学位论文作台中，用巴氏吸管弃去培养基，加入清洗细胞胰酶消化细胞，约后加入培养基终止消化。收集细胞悬液于离心管中，离心后弃上清，调整细胞密度后加入细胞培养瓶中于细胞培养箱中培养。冻存细胞细胞生长至融合，用清洗细胞后加入胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，离心后弃上清，加入冻存液重悬细胞，转入细胞冻存管中置于细胞冻存盒，放置后从冻存盒中取。

5、，将三次抽提液合并，在通风橱中待其挥发干燥。色谱纯的甲醇溶解沉淀后，以微孔滤膜过滤溶液，用型高效液相色谱仪检测样品中腐胺精脒或精胺的含量，检测波长均为，流动相为乙腈水，上机前乙腈与水需经微孔滤膜过滤后在超声清洗机中进行脱气。依次检测腐胺的含量。样品峰面积与内标峰面积的比值为，样品的质量浓度为，绘制腐胺的标准曲线。相同方法进行精脒精胺标准曲线的绘制。腐胺标准曲线精胺标准曲线精脒标准曲线，。样本的处理将。

6、测细胞内蛋白表达水平样本处理细胞用胰酶消化后，离心，洗次，加入细胞裂解液裂解细胞，离心，取上清，检测蛋白浓度，定量后加入蛋白上样缓冲液，混匀后，沸水中水浴。聚丙烯酰胺凝胶电泳待分离胶与浓缩胶均凝固后，在电泳槽中加入电泳缓冲液，根据蛋白定量结果依次上样，同时加入蛋白预染作为蛋白大小指示。以电压恒压电泳，待溴酚蓝指示带进入分离胶后约，将电压调至，恒压进行电泳，至溴酚蓝指示带电泳至分离胶底部结束电泳约。转。

7、混匀，静置，逐滴加入细胞培养皿中。后，将基础培养基更换为完全培养基。转染后收集细胞，进行后续检测。蛋白浓度测定样本处理使用法检测蛋白浓度。将试剂盒中液与液以混合，在混合液中加入及待测样品。混合均匀后，孵育，设置个复孔，用酶标检测仪检测波长处吸光值。绘制标准曲线用将稀释为与蛋白样品同法检测其吸光值，在表格中以吸光值为横坐标，浓度为纵坐标绘制散点图，添加线性回归线万方数据三峡大学硕士学位论文及其公式。得。

8、管中，加入异丙醇，充分混匀后离心。弃上清，加入水配制成的乙醇，混匀后离心，弃上清，冰上干燥。加入水溶解，紫外检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测质量。保存。反转录获取细胞中使用反转录试剂盒将细胞中总反转录为。取，加入引物，用水将体系调整为，混匀后，放入仪中加热后停止。取反应缓冲液酶抑制剂反转录酶混匀后加入预热后的反应体系中，混匀。置于仪中反应后，反应。得到的于保存。获取野生人源性目的基因以为模版，获取野生人。

9、出标准曲线公式为，。蛋白浓度的计算细胞裂解液与的吸光度之差为样品吸光度的校正值，将样品吸光度值与吸光度校正值之差代入标准曲线求出值乘以稀释倍数，则得到样品的蛋白浓度。多胺含量的测定标准曲线的绘制以盐酸作溶剂配制的腐胺精脒以及精胺。苯甲酰化处理取，加入腐胺内标化合物己二胺苯甲酰氯，涡旋振荡器振荡混匀后，恒温水浴箱水浴后，加入饱和氯化钠终止反应。在通风橱中，于苯甲酰化后的样品中加入乙醚，进行抽提，重复三。

10、影夹中，将显色用液与液等体积混合，滴于膜上，待显色液扩散，在膜上覆盖塑料薄膜，放上胶片，合上显影夹，根据荧光强弱确定显影时间。胶片依次通过显影液水定影液，水中去除定影液后晾干保存。真核表达质粒的构建万方数据三峡大学硕士学位论文人宫颈癌细胞中总的提取细胞生长至融合时，用洗两次，每个细胞瓶中加入，冰上静置，用细胞刮将细胞刮下，转移至无菌管中，冰上静置。每个管中加入氯仿，混匀后冰上静置，离心。将上清转移至。

11、源性目的基因。设计人源性基因的特异性引物，上游引物序列为末端添加个保护碱基和酶切位点下游引物序列为末端添加个保护碱基和酶切位点。反应体系为引物上游引物与下游引物各混合聚合酶。充分混合后瞬时离心，放入仪中。反应条件预变性变性，退火，延伸循环次延伸。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。空载质粒与野生人源性目的基因的酶切在空载质粒与获得的人源性目的基因中各加入限制性内切酶限制性内切酶酶切缓冲液，调节反应体系至，水。

12、在转膜夹子上依次放入转膜缓冲液完全浸泡的海绵及张滤纸，电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，甲醇激活的膜，转膜缓冲液完全浸泡的张滤纸及海绵，检查无气泡产生后，合上夹子放入加入转膜缓冲液的转膜槽子中，以电流恒流转膜，转膜槽子四周应用冰块进行降温，以防蛋白降解。抗体孵育将膜放入脱脂牛奶中，封闭，加入脱脂牛奶配制的抗，摇床孵育过夜，洗次，每次，加入配制的二抗，室温摇床孵育，洗次，每次。显色在暗室中，膜用滤纸吸干，放入显。

参考资料：

[1]选修4化学平衡常数PPT课件 编号35（第30页，发表于2022-06-25）

[2]选修4化学平衡常数PPT课件 编号41（第30页，发表于2022-06-25）

[3]选修4化学平衡常数PPT课件 编号31（第30页，发表于2022-06-25）

[4]选修4化学平衡常数PPT课件 编号49（第30页，发表于2022-06-25）

[5]选修4化学平衡常数PPT课件 编号24（第30页，发表于2022-06-25）

[6]选修4化学平衡常数PPT课件 编号25（第30页，发表于2022-06-25）

[7]选修4化学平衡常数PPT课件 编号31（第30页，发表于2022-06-25）

[8]选修4化学平衡常数PPT课件 编号34（第30页，发表于2022-06-25）

[9]选修9Unit2 PPT课件 编号32（第82页，发表于2022-06-25）

[10]选修9Unit2 PPT课件 编号35（第82页，发表于2022-06-25）

[11]选修9Unit2 PPT课件 编号33（第82页，发表于2022-06-25）

[12]选修9Unit2 PPT课件 编号29（第82页，发表于2022-06-25）

[13]选修9Unit2 PPT课件 编号38（第82页，发表于2022-06-25）

[14]选修9Unit2 PPT课件 编号49（第82页，发表于2022-06-25）

[15]选修9Unit2 PPT课件 编号28（第82页，发表于2022-06-25）

[16]选修9Unit2 PPT课件 编号42（第82页，发表于2022-06-25）

[17]选修9Unit2 PPT课件 编号26（第82页，发表于2022-06-25）

[18]选修9Unit2 PPT课件 编号32（第82页，发表于2022-06-25）

[19]选择午膳的店铺 编号33（第23页，发表于2022-06-25）

[20]选择午膳的店铺 编号32（第23页，发表于2022-06-25）