离心管中。保存质粒。扩增基因粗略定位选取部分型阳性菌株和型阳性的全部菌株，以上述小提质粒作为模板，进行扩增，反应体系及参数如上文所述。型碳青霉烯酶基因研究手工法大量提取质粒，操作步骤如下收获细菌将菌液倒入合适的离心管中离心分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目鲍曼不动杆菌耐药特性及内酰胺酶基因研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型科学型指导教师二年五月温州医学院硕士学位论文缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分年间鲍曼不动杆菌临床分布及耐药性变迁材料和方法结果分析与讨论第二部分鲍曼不动杆菌内酰胺酶检测与耐药相关性研究材料和方法结果分析与讨论小结正文参考文献附录致谢综述及参考文献独创性声明温州医学院硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称临床实验室标准化研究所美国模式菌种收集中心重症监护病房超广谱内酰胺酶头孢菌素酶不动杆菌所产的头孢菌素酶新德里金属内酰胺酶聚合酶链反应脉冲场凝胶电泳三磷酸脱氧核苷氨苄西林头孢他啶头孢曲松亚胺培南庆大霉素环丙沙星胰蛋白胨大豆琼脂温州医学院硕士学位论文鲍曼不动杆菌耐药特性及内酰胺酶基因研究摘要目的了解温州医学院附属第医院临床分离鲍曼不动杆菌的分布情况及耐药特性，为临床抗菌药物选择提供依据。研究临床分离鲍曼不动杆菌的超广谱内酰胺酶头孢菌素酶及部分碳青霉烯酶基因的产生情况和基因分布特征，分析不同基因型的耐药特性及其与内酰胺类抗菌药物耐药的相关性。研究产菌株的同源性，为控制耐药性的传播提供依据。方法回顾性调查临床分离鲍曼不动杆菌的临床感染分布特点，全自动微生物分析仪和纸片扩散法检测鲍曼不动杆菌对亚胺培南头孢他啶头孢曲松头孢唑林氨苄西林环丙沙星妥布霉素庆大霉素复方新诺明哌拉西林他唑巴坦和头孢哌酮舒巴坦的耐药性并分析其变迁情况。筛选株鲍曼不动杆菌中耐药基因，克隆播散现象严重。上。通过分析，株型阳性的鲍曼不动杆菌中，共分成个克隆。测序，经比对，基因型为检出阳性株，占另外，本研究发现株携带基因的鲍曼不动杆菌。阳性菌株接合转移试验均未见接合子生长，接合试验阴性。对部分阳性菌株提取质粒扩增，发现所有基因均位于质粒上。通过分析，株型阳性的鲍曼不动杆菌中，共分成个克隆。其中有株属于克隆，主要分布在监护病房，其他病区包括脑外神外烧伤创伤观察室和呼吸内科，提示同克隆株在相同病区和不同病区之间均存在不同程度的克隆播散，说明本院型流行株克隆播散现象严重。结论所测株鲍曼不动杆菌仅对少数抗菌药物敏感性稍高，对大多数抗菌药物尤其内酰胺类呈现较高的耐药性，且耐药性有明显上升趋势，耐药现象严重。温州医学院硕士学位论文株鲍曼不动杆菌基因型以为主，通过可知，其流行的主要形式为克隆播散，等基因都有检出基因型以为主，也都有检出。鲍曼不动杆菌阳性基因大多数位于质粒上。株对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌中，株携带型内酰胺酶基因，占，说明产型内酰胺酶是本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。株携带基因的鲍曼不动杆菌，质粒定位试验表明该基因位于约的质粒上此株细菌同时携带和型碳青霉烯酶基因。关键词鲍曼不动杆菌耐药性内酰胺酶基因型温州医学院硕士学位论文，温州医学院硕士学位论文，取胰化蛋白胨酵母提取物和氯化钠于烧杯中，加入约的去离子水，搅拌使充分溶解，用调值至，定容至，灭菌后于冰箱保存。冰乙酸以蒸馏水充分溶解，调节为，定容到，存于冰箱，使用时稀释倍。溴化乙锭在水中加入溴化乙锭，确保溶解，室温避光保存。上样缓冲液溴酚兰蔗糖加蒸馏水至，充分搅拌混匀。硼酸，或者粉末蒸馏水去氧胆酸十二烷基肌氨酸钠蒸馏水蒸馏水裂解液温州医学院硕士学位论文方法内酰胺酶基因检测采用法扩增内酰胺酶编码基因，包括碳青霉烯酶。采用煮沸法提取细菌基因组将血平板上过夜培养的单个菌落挑于含的管中过夜培养，然后于沸水中煮离心，上清液作为模板。各基因的扩增引物序列见表。表内酰胺酶基因的引物序列基因名称引物序列产物长度退火温度反应初筛每反应体系引物均为，温州医学院硕士学位论文，倍缓冲液，等不含，超纯水，模板液，总反应体积，见表。表初筛体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计反应测序每反应体系引物均为倍缓冲液，等不含，超纯水，模板液，总反应体积，见表。表测序体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计反应参数如下预变性，变性，退火，温州医学院硕士学位论文延伸，共循环次，最终延伸，最后保存。产物电泳检测用电子天平称取琼脂糖，量取，加入锥形瓶中，在微波炉中加热溶解直至溶液变清，制得的琼脂糖溶液待溶液冷却到左右，加入溴化乙锭，使其终浓度为，混匀将凝胶倒入凝胶槽中，放置梳子待凝胶完全凝固后，将凝胶槽放入盛有缓冲液的电泳槽中，缓缓垂直拔出梳子，凝胶应完全被缓冲液覆盖，般没过胶面约取扩增产物与上样缓冲液混匀，用加样枪依次加入凝胶样品孔中，以为标准盖上电泳槽，接通电源，以的电压进行电泳电泳结束后，用全自动凝胶成像分析系统观察结果，拍照保存。阳性产物测序与目的片段大小相符的阳性产物由北京华大基因公司纯化后进行正反向双向测序，测序结果先在本地数据库比对，然后再在中用进行比对分析。接合转移试验参照等方法，分别以大肠埃希菌对叠氮化钠耐药和大肠埃希菌对利福平耐药为接合实验受体菌，以基因阳性菌株为供体菌。方法为取对数生长期的供体菌及受体菌各加到新鲜液体培养基中过夜培养。接合子以胰蛋白胨大豆琼脂平板筛选，根据供体菌及受体菌的药敏结果确定筛选平板中药物的浓度，筛选平板中含叠氮化钠和含利福平头孢他啶，置孵育。接合转移实验判断标准见表。表接合转移实验判断标准接合转移实验供体菌受体菌接合子阳性不生长不生长生长阴性不生长不生长不生长失败供体菌或受体菌有种生长生长温州医学院硕士学位论文阳性基因质粒定位快速质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作步骤如下取过夜培养的菌液，加入离心管中离心分钟，尽量吸弃上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入已加入，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入，温和地上下颠倒混匀次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过分钟，以免质粒受损伤。向离心管中加入，立即温和地上下颠倒混匀次，此时出现白色絮状沉淀。，离心分钟，吸取上清，加入到已装入的中，注意不要吸出沉淀。，离心秒，倒掉中的废液，将放回中。向中加入已加入无水乙醇离心秒，倒掉中的废液，将重新放回收中。向中加入请先检查是否已加入无水乙醇离心分钟，倒掉中的废液，将重新放回收中。，离心分钟，倒掉废液。将置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的。将置于个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加，室温放置分钟离心分钟，将质粒溶液收集到用的技巧描绘的景象以及表达的情感等方面入手。答案此句运用拟人的修辞手法，写出了春光浓重扑面而来的景象，表现了作者的欣喜对春天的喜爱之情。阅读下面这首清诗，然后回答题。分出关徐兰凭山俯海古边州，旆影风翻见戍楼。马后桃花马前雪，出关争得不回头。注关，指居庸关。旆，旌旗。诗的前二句，有版本作“将军此去必封侯，士卒何心肯逗留”，与本诗相比你更喜欢哪种请简要说明理由。分答答案更喜欢本诗。本诗前两句点出居庸关的雄壮气势，景物描写鲜明生动，为后面抒情作了铺垫。“将军”两句缺乏形象感，并且与全诗思乡的情感内容不相称。意对即可“马后桃花马前雪”句在艺术表现上有什么特点请作简要分析。分答答案将关内桃花烂漫与关外白雪茫茫两个场景聚集到征马这关节点上，描写生动，对比鲜明。“桃花”与“雪”分别代指家乡的温馨与塞外的清冷生活，在诗中具有象征意义，蕴含了思乡的情感。阅读下面的宋诗，然后回答题。分骤雨华岳牛尾乌云泼浓墨，牛头风雨翩车轴。怒涛顷刻卷沙滩，十万军声吼鸣瀑。牧童家住溪西曲，侵早骑牛牧溪北。慌忙冒雨急渡溪，雨势骤晴山又绿。第三四句中“卷”“吼”两个词有什么表达效果请结合诗句简析。分答答案“卷”从视觉角度，写出了骤雨袭来时的迅猛态势。简介答案岸旁杨柳都认得自己，眼底云山也极力挽留“我”，诗人故意将景物拟人化，明明是自己喜欢杨柳，依恋眼底云山，却从对面写来，故意说成是岸旁杨柳都认得自己，眼底云山也依依挽留自己。这样写既突出诗人对这带风物的熟悉，也包括了诗人对此间风物的深情，显得不落俗套又更有情趣。桂林高三检测阅读下面这首宋诗，完成后面题。分途中赵汝雨中奔走十来程，风卷云开陡顿晴。双燕引雏花下教，鸠唤妇树梢鸣。烟江远认帆樯影，山舍微闻机杼声。最爱水边数株柳，翠条浓处两三莺。本诗写了哪些“途中”所见景致表达了诗人怎样的情趣分答答案“途中”所见景致雨后云开天晴，燕戏花下，鸠鸣树梢，江面帆影隐隐可见，山舍机杼微微可闻，水边柳丛传出几声莺啼。诗人情趣醉心自然，热爱春天。请对本诗颔联“双燕引雏花下教，鸠唤妇树梢鸣”作简要赏析。分答答案本联运用了融情于景和拟人写法，生动地描绘了两幅美丽画面春花之下，双燕正在教育儿女，家子其乐融融树梢之上，雄鸠正在呼唤雌鸠，夫妻俩情意绵绵。画面既富于自然生机，也似染上人间温情，充分体现了自然风物的可爱，寄寓了诗人热爱自然赞美春天之情。西安高三检测阅读下面这首清诗，然后回答题。分独秀峰袁枚来龙去脉绝无有，突然峰插南斗。桂林山水奇八九，独秀峰尤冠其首。三百六级登其巅，城烟水来眼前。青山尚且直如弦，人生孤立何伤焉。注独秀峰位于桂林市中心，以平地孤拔，无他峰相对，故名。来龙去脉旧时堪舆风水先生以山势为龙，以山势起伏连绵为龙脉。南斗星宿名，在南天。伤妨碍。请赏析第二句中“插”字的妙处。分答答案“插”字以动写静，化静为动，赋予静态的山以动感和勃勃生机，生动形象地描绘出了独秀峰那刺穿青天的孤高与挺拔之势。细读本诗，说说袁枚通过这首诗写出了自己怎样的处境和心境。分答答案作者的处境像独秀峰样孤独孤立。作者的心境有恪守正直秉性，甘愿特立独行，不因孤独而伤感，永不言败，永不退缩的坚毅积极乐观向上进取有对人生境遇的微微怨嗟