【42页】【毕业设计】德国小蠊过敏原Blag8基因的克隆及原核表达.doc文档在线阅读

根据蜚蠊化石的考证，它们在地球上生存了亿多年。

德国小蠊分布最广泛与人类生活最为密切相关，目前是我国的室内优势种群之。

德国小蠊是世界性的重要卫生害虫，其不但能够机械传播多种病原体，例如细菌性痢疾伤寒肝炎等疾病，国内的研究结果也表明，德国小蠊能携带痢疾杆菌绿脓杆菌变形杆菌沙门杆菌伤寒杆菌和寄生虫卵等病原体。

而且德国小蠊是最主要的引起变态反应的蟑螂之，其体壁分泌物排泄物虫卵尸体蜕皮碎屑等经吸入人体，从而使有过敏体质的患者出现皮疹哮喘和打喷嚏等症状，是重要的过敏原，可引起Ⅰ型变态反应。

过敏性疾病是临床上的常见病和多发病，并有逐年增多趋势，引起人们的关注，蟑螂是主要的吸入性变应原之，可导致哮喘及其它过敏性疾病。

目前，临床上对蟑螂过敏原患者进行体内外诊断和特异性免疫治疗时，仍广泛使用蟑螂粗浸液，但粗浸液中含有大量非致敏组分，稳定性差，难以标准化。

故整个蟑螂虫体浸出液用于变态反应疾病的诊断和脱敏治疗存在许多不足，而蟑螂重组变应原很好的解决了这些问题。

因此，获得编码德国小蠊过敏原的基因就尤为重要。

蟑螂的主要变应原已陆续被鉴定和克隆。

截至年月日，国际免疫学会联合会收录的德国小蠊变应原有微肠绒毛同源蛋白天冬氨酸蛋白酶载脂蛋白谷胱甘肽转移酶肌钙蛋白原肌球蛋白及肌球蛋白轻链。

其中，德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达种德国小蠊变应原被克隆表达并鉴定出免疫学特性，而仅见上传序列序列不完整，缺少端，未见任何关于其变应原性分析及鉴定等的相关资料报道，其序列的完整性是否会影响其变应原性尚需进步对研究。

本研究利技术，获得编码德国小蠊变应原的完整序列。

利用和网站的在线软件对变应原进行分析，获得其有关生物信息学资料，利用软件预测该蛋白抗原表位。

为进步研制基因工程变应原用于临床诊断和免疫治疗奠定了基础。

材料与方法材料物种来源德国小蠊从上海生科院引种后，贵阳医学院生物学教研室长期繁殖饲养所得。

主要试剂氯化钙恒因生物琼脂糖恒因生物恒因生物硼酸乙二胺四乙酸恒因生物无水乙醇蔗糖两步法逆转录试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒宝生物有限公司胰蛋白胨恒因生物德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达酵母浸出粉恒因生物低熔点琼脂糖恒因生物质粒小提试剂盒恒因生物标准甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺甲醇甘氨酸盐酸溴酚蓝二甲苯吉氏染色剂十二烷基硫酸钠，二甲基甲醛胺考马斯亮蓝乙二胺四乙酸咪唑酶标抗酶标二抗封闭液底物显色剂甘油以上试剂未注明者均为国产分析纯。

主要仪器梯度仪，移液器，德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达低温冷冻离心机，磁力加热搅拌器，武汉精华科教仪器有限公司台式高速离心机，江苏太仓市医疗器械厂电热恒温水温箱型三用水箱，金坛市富华仪器有限公司净化工作台，苏州净化设备有限公司多用途水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂微波炉，广东顺德市格兰仕电器实业有限公司双恒电泳仪，北京东方仪器厂琼脂糖凝胶电泳槽，北京六仪器厂电热鼓风恒温干燥箱，四川成都电烘箱厂旋涡混合机，江苏太仓市科教器材厂电子分析天平，仪，上海精科雷磁公司三恒电泳仪，北京六仪器厂蛋白凝胶电泳槽北京百晶生物技术有限公司凝胶成像系统，昆明纳瑞科技有限公司生物信息分析软件序列相似性检索软件序列结构及理化性质分析软件网站的功能检测的变应原性，通过软件预测该蛋白的抗原表位。

方法部分序列的获取在进行搜索获得德国小蠊变应原部分序列，但，端有缺失，是属于的肌球蛋白轻链。

获取全长序列，引物的设计根据已公布的德国小蠊变应原基因部分序列及引物设计要求设计出引物，由上海生工合成。

，所用引物序列如下德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达表所示表引物引物名称引物序列下游引物下游引物通用引物通用引物的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。

本研究利用软件中的模块，对蛋白的亲水性柔韧性表面可及性及抗原性指数进行综合分析后，发现该蛋白有个潜在的抗原表位，该结果可以为寻找的最佳优势表位区给予很大的支持作用，同时也为该蛋白的单克隆抗体的制备和相关研究等提供了理论依据。

再次该结果进步证实了该序列编码的蛋白变应原性。

综上所述，本实验通过技术首次获得了德国小蠊过敏原的完整编码序列，首次成功构建了蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中诱导表达出以可溶性形式为主的重组德国小蠊过敏原蛋白，应用免疫印迹法对其进行了分析和鉴定。

本文运用生物信息学的方法得到德国小蠊蛋白的结构信息及细胞表位信息，为德国小蠊蛋白的过敏性的深入研究和进步开展过敏性疾病免疫诊断和治疗奠定了信息基础。

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