酸不包括任何磷酸基团。我们完成了脱腺苷化与Ⅱ浓度检测，变以下倍以上倍浓度准试验条件。有趣是，根据条件测试，镁Ⅱ浓度很难颠倒对，和抑制作用图。这些数据表明，新型人工合成化合物作用是独立当地镁Ⅱ浓度，而这些抑制效应化合物不能被剥夺，通过改变镁Ⅱ水平。图镁在抑制中通过核苷酸中嘌呤碱效果。顶部相关活动抑制由空条子或者实条子来呈现，，镁。底部相关活动呈现了空条子或实条子来呈现，，镁。结果是意味着至少三种独立试验价值形式。预测，和烷二甲基甲酰胺，通过乙酰化后自由羟基集团在位糖基醋酸酸酐吡啶，去除异亚丙基，而且，最后，选择性保护主要羟基组组取得了三苯甲基化合物。氧化氟乙酰化前体与吡啶踵铬酸盐乙酸酐给予脱氧氟型三苯甲基苯甲酰基腺嘌呤。表达和纯化重组。质粒编码全尺寸人类教授提供瑞典用于末端标签多肽表达，被传递给细胞去表达重组蛋白，如前所述，加入些修改。简单地说，菌落生长在过夜卡那霉素。培养物在稀释后在相同被异丙基硫代半乳糖苷诱导个最终浓度培养基中生长。用于表达培养液被允许在下培养小时。在下经离心法收集细胞要分钟，和颗粒被冻结在。表达了他标记可溶性蛋白进行纯化下列先前描述协议。活性测定和动力学分析。如所述前，酶活性可以被亚甲蓝所测定。作为时间函数脱腺苷酶率被确定用时间进程分析图。亚甲蓝是由亚甲蓝溶解在吗啉基丙磺酸缓冲液中制备而成吗啉基丙磺酸氢氧化钾，值和。标准反应缓冲液含羟乙基哌嗪乙磺酸氢氧化钾值，氯化镁，氯化钾，酶，乙二胺四乙酸，，甘油，聚。所有核苷酸溶解在反应缓冲液后才能使用。反应进行了利用重组。对于动力学分析，底物浓度聚条介于至。最终反应容积为，反应是在进行分钟。反应终止是通过反应液和亚甲基蓝混合，混合液培养是在黑暗水浴器中分钟。样品在分光光度计下测量。协调准备相配之物都是从已知晶体结构得到与蛋白数据库样放置。其中个两个相同二聚体形式活性中心被用于对接计算。全部结晶水分子从坐标文件删除之前对接。氢原子和部分收费经过分子操作环境有效性测量程序使用力场添加到了酶上。有效性测量使用方法来分配所有潜在抑制剂化合物部分费用。毕竟非氢原子被固定，分子被大力减少由最速下降组合，共轭梯度，并截断牛顿极小化方法在有效性测量。能量最低化也进行到放宽基板前对接。分子对接。有效性测量是用来执行对接试验和溶剂化和计算相对结合自由能。有效性测量模块利用模拟退火方法计算对接。对接网格间距掳分箱放在围绕这目蛋白活性部位。该迭代限制设置为，循环次数设置为，在运行数设置为。分子动力学模拟。分子动力学模拟进行了利用有效性测量和其内置医师模块使用系综氮，原子数目五，体积笔，温度。该化合物与酶复合物对接最初优化是通过能量最小化利用有效性测量力场。每复杂后来在个明确溶剂化水分子定期盒延长来自蛋白原子。周期边界被使用，以减少边缘效应。水结构最初为平衡保持整个蛋白质固定其次是骨干固定蛋白质平衡。在平衡阶段之后是模拟用时间步来整合快速扫描势函数。被截止至少要有被使用。结果，和是竞争抑制剂抑制活动。在我们以往研究基础上显示磷酸腺苷，在脱腺苷化产品之，作为竞争行为对抑制剂，我们搜索了类似化学性质抑制剂。我们研究了系列氟代嘧啶核苷潜在抑制效果如图。它有最近表明，其中些化合物具有肿瘤抑制效果，以及在细胞抗病毒活性。初步筛选了这些核苷关于作用活动表明，和可以有效地抑制，化合物和和没有显着影响数据未显示。为了进步了解，和核苷类似物抑制作用，我们进行详细动力学分析，结果发现这些化合物表现为在体外高效率竞争性抑制剂。随后，从我们动力学分析确定了抑制常数文插图，如图所示这三个化合物。就，计算基值和，抑制常数为表，图。同样动力学分析氟代嘧啶核苷胞嘧啶核苷与缺乏苯甲酰修改，这也抑制活动图用毫米。三脱氧氟葡萄糖，只包含同没有相应糖环成分，无明显抑制并在随后分析作为阴性对照组数据未显示。此外，我们比较了这些化合物与自然核苷酸抑制作用，作为个有竞争力表现抑制剂。该抑制常数为图，与类似，但比高。表总结了所有在研究中使用化合物抑制常数。这些结果表明，可以有效地抑制合成核苷是在目前进行了测试研究，具有竞争力方式，意味着这种抑制作用依赖于对大自然了解糖基比该基地性质。此外，我们数据表明，可能是个新分子针对这些化合物在体外。图镁Ⅱ离子不释放，和抑制剂。以往研究表明，镁离子对活动有重要作用，尽管没有这样离子在活跃截断晶体结构中被发现图苯甲酰氟代嘧啶核苷抑制活动和是非竞争性抑制剂。双倒数图对基板在存在活动或所示。在充满标记浓度分别为圈，三角形，，以及倒三角形。浓度在空标记分别为圈，为三角形，方，倒三角形。至少有三个有代表性独立实验显示。插图斜坡公里值双重相对于核苷酸浓度倒数线。图和磷酸胞嘧啶是非竞争性抑制剂。双对基活动倒数作图存在在充满标记或磷酸胞嘧啶在空标记显示。浓度在充满标记和磷酸胞嘧啶在空标记是为三角形，圈，方，和倒三角形。代表至少有三个独立实验曲线显示。插图相对于核苷酸双倒数线斜坡浓度。此外，在我们以前报告中，我们观察到，增加镁离子浓度可以扭转自然抑制二和三磷酸核苷酸而不是通过抑制磷酸核苷酸。因此，我们要排除可以被合成核苷抑制可能性，不知何故，被救出使用过量镁Ⅱ，虽然这些核苷酸不包括任何磷酸基团。我们完成了脱腺苷化与Ⅱ浓度检测，变以下倍以上倍浓度准试验条件。有趣是，根据条件测试，镁Ⅱ浓度很难颠倒对，和抑制作用图。这些数据表明，新型人工合成化合物作用是独立当地镁Ⅱ浓度，而这些抑制效应化合物不能被剥夺，通过改变镁Ⅱ水平。图镁在抑制中通过核苷酸中嘌呤碱效果。顶部相关活动抑制由空条子或者实条子来呈现，，镁。底部相关活动呈现了空条子或实条子来呈现，，镁。结果是意味着至少三种独立试验价值形式。预测，和构相似天然核苷酸如值相比较。比较和结构相似天然核苷酸值，它们都以携带胞嘧啶为基础分别为，和，很明显苯甲酰改进对更有效抑制作用是至关重要。这或许可以归因于个事实，即该组结构有助于核苷在活性部位更好地适应，其电荷可以稳定和关键催化氨基酸相互作用。最后，最初化合物以种招标模式在酶活性部位显示无共识，在酶活性上没有抑制作用，观察也被体外生化分析证明了数据未显示。为了获取和如何与活性部位相互作用信息和支持生物化学数据，我们进行分子动力学模拟。我们研究结果表明，所有三个化合物可以容纳到酶活性部位，从而有利于通过特定相互作用有效地抑制它活动。能有竞争性地抑制，但当糖上基团被乙酰或者甚至体积更大三苯甲基组复合，和取代时，没有抑制被观察到。这种无效很可能归因于不同化学行为和体积较大乙酰基组可能不适合进入催化袋。对进行了类似观察，在糖基羟基上暗示个至关重要作用。此外，苯甲酰基存在提高了胞核嘧啶基地抑制作用，和相比，反映在化合物和值上表。我们数据表明，与胞嘧啶为基础化合物相比，由芳香环形成体积大共轭核心降低了其抑制效力。然而，与相比，化合物额外苯环贡献进步改善其亲和力，使其成为更有效抑制剂。在这项工作中提出硅片分析表明糖基和主要催化氨基酸之间重要相互作用，同时在中聚限制形式实验中也观察到。在其活性部位最佳结合方向是允许糖环基团与三个催化残基图建立氢键相互作用，以及为了六元糖环和受体之间已增强相互疏水作用。再加个额外苯基化合物提高受体活性部位相互作用图。结合和值，我们数据表明，至少在这里测试在被改进核苷情况下，对于胞嘧啶有个较高亲和力，而不是对于基于腺嘌呤化合物。虽然从聚中区分聚，但不能降解聚或聚，似乎至少在这种被改进核苷测试情况下，它更好结合个胞核嘧啶而不是种腺嘌呤。值得注意是，基体识别仍是个未解决问题。个重要观察尽管事实上酶有效降解聚，但是在腺嘌呤基地和酶之间没有特定氢键之间相互作用。在该类似物作用下，脱腺苷化反应中二价镁离子介入也进行了研究。之前我们已经表明，当二价镁浓度增加而不是带有个磷酸基和核苷酸浓度增加时，嘌呤核苷酸抑制作用会使三个磷酸基和或两个磷酸基和被释放。我们研究结果符合这些观察而且表明，二价镁促进作用通过改进核苷并不影响抑制作用，这可能是因为缺乏任何磷酸基。些研究关于二价镁离子结合模式到磷酸基进行辩论。据报道，二价镁只结合磷酸盐，即是种，双齿或和，双齿混合物，最后，金属与和磷酸和所有磷酸盐相互作用。在活性部位，对二价镁积极参与机制实际作用进行了详细研究。在那份报告中，提出对两个金属离子示意图是基于以前同组报告表明活性部位类似于聚合酶中个核酸外切酶活性部位。作者认为三个天冬氨酸残基和和个谷氨酸残基可通过水分子直接或间接协调衔接两个金属离子。然而，二价镁可代替其他二价金属离子如或，在对镁离子本身催化机理绝对要求提出问题。此外，据报道，新霉素作为种混合非竞争性抑制剂，其二价镁离子释放和聚合酶活性克莱片段抑制作用。在该报告中，作者表明对于，新霉素中钾和二价镁离子浓度无关，并认为新霉素和二价离子为同站点或重叠结合位点竞争。众所周知，在又脱氧核糖核酸情况下，比如聚合酶克莱片段，二价镁很难用和蛋白质结合，单金属离子和双金属离子机制都已经被提出来了。因此，二价镁无法释放抑制作用这可能由于金属对酶亲和力弱或重叠对金属和抑制剂结合点。如上所述，个截断人类末端晶体结构是在两种状态下来决定自由和结合形式，但有趣是，作者报道说，尽管二价镁包括在这机制条件下在同数量级标准统试验下使用，即至之间。在这个报告中，晶体数据显示，活动所必需氨基酸，例如无论和核糖或个寡核苷酸基板磷酸基团都很好相互作用，而生化数据显示，对催化活性以及与磷酸盐相互作用也是必不可少。在我们分析中，同样氨基酸都参与了在活性部位核苷糖基协调。此外，事实上，增加二价镁确实可以通过嘌呤三和二磷酸核苷酸和释放抑制活性，而不是通过单磷酸核苷酸，这表明可能是金属