肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中，用玻璃刮铲将菌液涂布 均匀，再将浸透被测样品液的滤纸片放在培养基的表面，标记后置 于恒温箱中培养，观察抑菌效果，测 离到了三个特异表达的分子，并使用技术克隆了它们的全长基因。 这些工作为本项目的实施奠定了基础。 二技术方案论述 项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到的技 术水平 目前，人们主要以两种方法获得抗菌肽。其是直接从生物体 内分离抗菌肽，用这种方法不能获得大量的抗菌肽。其二是根据 已发现的抗菌肽基因的序列设计引物在不同的生物中通过技 术克隆抗菌肽基因，该方法只能在不同生物中获得该抗菌肽的同 源基因，而不能获得新的抗菌肽基因。在本项目中，我们将前期 工作中获得的抗菌肽基因与载体连接，构建抗菌肽酵母高效表达 体系，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，用这种方法可获得大量 新的高效广谱抗菌肽。 计算机检索结果表明，人们对昆虫抗菌肽进行了较多的研究， 而对鱼类抗菌肽研究很少。目前国内只有厦门大学最近采用传统 方法从海水养殖的鲈鱼中分离出种抗菌肽基因，但并未对该基因的表达及其产物的抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类 抗菌肽基因的广谱抗菌肽制剂。本项目将开发出具有自主知识产 权的新型抗菌肽制剂。 项目完成时至少可达到国内领先水平。 项目技术方案论述生产技术工艺流程主要技术 参数 将采用技术从鱼类克隆的抗菌肽全长基因与表达载 体连接构建重组载体重组载体转入酵母筛选抗菌肽，病毒的作用。因此 对社会发展具有重要的作用。 对资源利用情况 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短， 生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。工程菌发酵 原料易得，不会破坏和浪费农业资源。 对人才培养情况 本课题的实施将为我国培养名生物化学和分子生物学及微 生物学专业的硕士研究生。 环境影响及效益。 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，在生产和推广应用过程中均 不会影响生态环境。 选题的必要性 项目所处技术领域产业政策 自从青霉素被发现以来，人们对病原菌引起的感染性疾病不 再束手无策，特别是内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性 疾病的治疗产生了革命性飞跃，抗生素已成为临床治疗病原菌感 染的强有力武器。但是，随着抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药 菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。为了应对耐 药菌感染，人们方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌的 耐药性，另方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出 现的抗菌肽就是类具有巨大发展 潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的类抵抗外界病原体感染 的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫植物动物及人体内，具 有非特异性抗细菌真菌病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞 作用，因此肽高效 表达酵母体系大量表达抗菌肽抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测 定抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验 重组表达载体的构建 将我们从淡水鱼中诱导表达的抗菌肽基因与具有高效表达启动 子的表达载体连接，构建重组表达载体。 抗菌肽基因酵母表达体系的构建及高效表达系统的筛选 采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因 酵母表达系统。采用法和法从转录和翻译两个水 平上筛选抗菌肽高效表达酵母。 抗菌肽的大量表达。 利用筛选到的高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。 抗菌肽的分离纯化。 离心收集表达上清液，采用硫酸铵沉淀抗菌肽。经 层析，收集各个洗脱峰，用的分析鉴定目的多肽 所在的峰。将含有目的多肽的洗脱液用透析，冻干浓缩。多肽于 保存，用于分析鉴定及生物功能试验。 抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。 采用琼脂扩散纸片法。以大肠杆菌沙门氏菌，肠球菌链球菌 分枝杆菌巴氏杆菌布鲁氏菌弧菌痢疾杆菌绿脓杆菌梭 状芽孢杆菌李氏杆菌巨大芽孢杆菌醋酸钙不动杆菌金黄 色葡萄球菌化脓链状球菌流感病毒疱疹病毒为受抑菌。将大 肠杆菌等受抑菌培养