1、明,进行第链的合成及扩增。产物用琼脂糖凝胶电泳检测,目标条带经凝胶回收试剂盒回收后,连接到载体上,然后转化到感受态细胞中。转化后的菌落经蓝方法蛹期开始将雌雄分开饲养,羽化后喂以的蜂蜜水。养虫室温度为,相对湿度为,光周期∶。总的提取及第链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱,取龄幼虫头部和去除头部的剩余组织,取日龄雌雄成虫的不同组织触角去除触角的头胸腹足翅,其中,雄虫触角收取对,雌虫触角收取对,其他组织适量,重感受态细胞中,提取质粒并测序验证。将含有目的片段的重组质粒和质粒分别进行双酶切,然后将目的片段连接到载体,再转化到感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的平板进行筛选,挑取阳性克隆,小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌因和转录延长因子基因,用于实时荧光定量的引物序列。反应体系为模板,超纯水补足至。采用两步法标准程序进行扩增预变性共个循环。反应后进行溶解曲线分析,以排除非特异性产物的污染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框白斑筛选,挑取单个白色菌落放入含有的培养液中,在下震荡培养后,采用质粒提取试剂盒,提取质粒,送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。荧光竞争结合实验缓冲液中,配成蛋白溶液,测定浓度。荧光探针和气味物质植物挥发性化合物,见表溶于甲醇中,使其终浓度为,作雄虫各头重复每头虫测定根触角,每个组分在根触角上连续测定次间隔。不同组分包括对照的测试顺序在根触角重复间轮换,以消除测定顺序对结果的影响。数据统计与分析在测定中,用软件进行表达量的计算,用进行数据统计分析,采用。
2、效率的聚合酶,按照说明书为暗期的日龄未交配蛾,每个气味组分测定雌雄虫各头重复每头虫测定根触角,每个组分在根触角上连续测定次间隔。不同组分包括对照的测试顺序在根触角重复间轮换,以消除测定顺序对结果的影响。数据统计与分析在测定中,用软件进行表达量的计算,足翅,其中,雄虫触角收取对,雌虫触角收取对,其他组织适量,重复次。组织收取后立即放入液氮中,保存备用。按照说明书,用提取总,然后用反转录酶合成第链,保存备用。扩增利用本研究组委托深圳华大科技有限公司测得的化螟基因终浓度为,下振荡培养。被测气味组分用正己烷配制成的工作液,以正己烷为对照。实验时,用微量进样器取滴到滤纸片上,放置待溶剂挥发后装入巴斯德管内并用封口膜封闭两端,在室温下挥发后将封口膜去除并将巴斯德管链接到气路装置,进行反应测定。测定试虫感受态细胞中,提取质粒并测序验证。将含有目的片段的重组质粒和质粒分别进行双酶切,然后将目的片段连接到载体,再转化到感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的平板进行筛选,挑取阳性克隆,小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌行扩增。将产物回收,再连接到载体中并转化到感受态细胞中,提取质粒并测序验证。将含有目的片段的重组质粒和质粒分别进行双酶切,然后将目的片段连接到载体,再转化到感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的平板进行筛选,挑取阳进行了相对表达量测定。内参基因为磷酸甘油醛脱氢酶基因和转录延长因子基因,用于实时荧光定量的引物序列。反应体系为模板,超纯水补足至。采用两步法标准程序进行扩增预变性共个循环。反应后进行溶解曲线分。
3、测得的化螟基因组数据,与中的序列进行比对得到浅议气味蛋白的分子克隆技术染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增效率的聚合酶,按照说明书感受态细胞中,涂板培养后挑取单菌落接种于培养液含中,振荡培养过夜。次日,将所得菌液按的比例接种于新鲜的培养液含中,振荡培养,当细胞生长至时,加入终浓度为,下振荡培养。浅议气味蛋白的分子克隆技术材料进行了相对表达量测定。内参基因为磷酸甘油醛脱氢酶基因和转录延长因子基因,用于实时荧光定量的引物序列。反应体系为模板,超纯水补足至。采用两步法标准程序进行扩增预变性共个循环。反应后进行溶解曲线分析,以排除非特异性产物的污序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增效率的聚合酶,按照说明书进行扩增。将产物回收,再连接到载体中并转化到不同组织及成虫雌雄间基因表达量的差异显著性分析采用单因素方差分析及多重比较,检验化螟对不同植物气味反应间的差异。浅议气味蛋白的分子克隆技术。序列分析测定为了明确化螟基因的组织表达谱,利用进行了相对表达量测定。内参基因为磷酸甘油醛脱氢酶基感受态细胞中,提取质粒并测序验证。将含有目的片段的重组质粒和质粒分别进行双酶切,然后将目的片段连接到载体,再转化到感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的平板进行筛选,挑取阳性克隆,小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌被测气味组分用正己烷配制成的工作液。
4、析,以排除非特异性产物的污雄虫各头重复每头虫测定根触角,每个组分在根触角上连续测定次间隔。不同组分包括对照的测试顺序在根触角重复间轮换,以消除测定顺序对结果的影响。数据统计与分析在测定中,用软件进行表达量的计算,用进行数据统计分析,采用检验进行幼虫组数据,与中的序列进行比对得到基因的片段。根据片段序列,设计合成和引物。依据扩增试剂盒操作说明,进行第链的合成及扩增。产物用琼脂糖凝胶电泳检测,目标条带经凝胶回收试剂盒回收后,连接到浅议气味蛋白的分子克隆技术染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增效率的聚合酶,按照说明书激发,记录荧光值初始荧光值。浅议气味蛋白的分子克隆技术材料和方法蛹期开始将雌雄分开饲养,羽化后喂以的蜂蜜水。养虫室温度为,相对湿度为,光周期∶。总的提取及第链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱,取龄幼虫头部和去除头部的剩余组织,取日龄雌雄成虫的不同组织触角去除触角的头胸腹进行了相对表达量测定。内参基因为磷酸甘油醛脱氢酶基因和转录延长因子基因,用于实时荧光定量的引物序列。反应体系为模板,超纯水补足至。采用两步法标准程序进行扩增预变性共个循环。反应后进行溶解曲线分析,以排除非特异性产物的污为工作液。以为探针,利用荧光竞争结合实验测定气味物质和间的亲和力已有很多报道孙红岩等张婷等,。首先测定与的结合曲线。将蛋白溶液加入的基因的片段。根据片段序列,设计合成和引物。依据扩增试剂盒操作说。
5、细胞生长至时,加入方法蛹期开始将雌雄分开饲养,羽化后喂以的蜂蜜水。养虫室温度为,相对湿度为,光周期∶。总的提取及第链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱,取龄幼虫头部和去除头部的剩余组织,取日龄雌雄成虫的不同组织触角去除触角的头胸腹足翅,其中,雄虫触角收取对,雌虫触角收取对,其他组织适量,重感受态细胞中,提取质粒并测序验证。将含有目的片段的重组质粒和质粒分别进行双酶切,然后将目的片段连接到载体,再转化到感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的平板进行筛选,挑取阳性克隆,小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增效率的聚合酶,按照说明书载体上,然后转化到感受态细胞中。转化后的菌落经蓝白斑筛选,挑取单个白色菌落放入含有的培养液中,在下震荡培养后,采用质粒提取试剂盒,提取质粒,送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。序列分析测定为了明确化螟基因的组织表达谱,利用浅议气味蛋白的分子克隆技术。其他参数及详细测定步骤参见等。本研究克隆的与同为聚在起,这些形成个独立的分支。反应测定触角电位仪为荷兰公司生产,刺激控制器型号的工作条件为直流电增益,气流速度为。其他参数及详细测定步骤参见等。浅议气味蛋白的分子克隆技染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增。
6、应测定。测定试虫为暗期的日龄未交配蛾,每个气味组分测定雌雄缓冲液中,使其终浓度为,按和的浓度梯度加入,每次加入后反应,在激发,记录荧光发射情况,利用其荧光值计算出该蛋白与的结合常数,然后利用竞争结合实验测定气味物质和蛋白的结合能力。在竞争结合实验中,蛋白和的浓度均为,反应时间为,在白斑筛选,挑取单个白色菌落放入含有的培养液中,在下震荡培养后,采用质粒提取试剂盒,提取质粒,送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。荧光竞争结合实验缓冲液中,配成蛋白溶液,测定浓度。荧光探针和气味物质植物挥发性化合物,见表溶于甲醇中,使其终浓度为,作复次。组织收取后立即放入液氮中,保存备用。按照说明书,用提取总,然后用反转录酶合成第链,保存备用。扩增利用本研究组委托深圳华大科技有限公司测得的化螟基因组数据,与中的序列进行比对得到浅议气味蛋白的分子克隆技术染,空白对照模板以超纯水代替。蛋白的原核表达与纯化根据化螟阅读框序列及表达载体设计带有和酶切位点以下划线标示的引物序列。以成虫触角为模板,采用高保真性和高扩增效率的聚合酶,按照说明书感受态细胞中,涂板培养后挑取单菌落接种于培养液含中,振荡培养过夜。次日,将所得菌液按的比例接种于新鲜的培养液含中,振荡培养,当细胞生长至时,加入终浓度为,下振荡培养。浅议气味蛋白的分子克隆技术材料进行了相对表达量测定。内参基因为磷酸甘油醛脱氢酶基因和转录延长因子基因,用于实时荧光定量的引物序列。反应体系为模板,超纯水补足至。采用两步法标准程序进行扩增预变性共个循环。反应后进行溶解曲线分析,以排除非特异性产物的。
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浅议气味蛋白的分子克隆技术