1、分离得到的淋巴细胞混合共培养后，利用杀伤活性测定来检测共培养的淋巴细胞的增殖能力及和杀伤活性。以转染空载质粒组为阴性对照。利用检测淋巴细胞与稳转细胞株混合共培养后，其增殖及杀伤活性的抑制作用，进步探讨恢复对肿瘤特异性细胞的抑制作用。结果利用流式细胞术检测本实验室已建立的稳转细胞株中明显高表达于对照组。成功克隆并构建真核表达载体质粒，经酶切和测序鉴定完全正确。将构建好的真核表达质粒转染人宫颈癌细胞，并经过嘌呤霉素的筛选阳性克隆，经过扩大培养后，利用及免疫荧光鉴定成功获得稳定克隆细胞株。利用杀伤活性测定检测与稳转细胞混合共培养的人淋巴细胞较阴性对照组明显增强淋巴细胞细胞因子表达量明显增多，淋巴细胞的增殖能力及杀伤活性都显著增加。利用检测淋巴细胞与稳转细胞株混合共培养，淋巴细胞的增殖活性较阴性对照组显著抑制。将转入基因的克隆细胞与淋巴细胞共培养时发现，对淋巴细胞生物活性的抑制作用得以逆转。结论上调表达是宫颈癌免疫逃逸机制之，将稳定转染了可溶性基因的细胞与人淋巴细胞共培养，发现淋巴细胞的增殖能力及及杀伤活性明显增强，而可使人淋巴细胞增殖能力及及杀伤活性受到抑制，由此推断，可溶性可恢复因癌基因对肿瘤特异性淋巴细胞生物活性的抑制作用，改善细胞免疫功能缺陷，避免使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控，促万方数据三峡大学硕士学位论文进肿瘤免疫治疗效果。利用可溶性阻断信号途径后可有望为宫颈癌分子免疫治疗提供新的策略。关键词宫颈癌免疫治疗万方数据三峡大学硕士学位论。
2、切。表双酶切体系试剂剂量共缓冲液Ⅱ内切酶Ⅰ内切酶模板双蒸水反应条件混匀后水浴。将酶切产物利用纯化试剂盒纯化，并用于后续连接反应。真核质粒的连接将中酶切并纯化的产物按表的连接体系进行连接。表连接体系试剂剂量共基因双酶切产物质粒双酶切产物连接酶双蒸水万方数据三峡大学硕士学位论文反应条件为水浴，反应。重组质粒的提取及鉴定将连接生成物通过感受态转化法处理，并涂布在含抗性的固体培养皿中进行单克隆的筛选，将挑取到的单克隆菌落转接入含抗性的培养液，置于的摇床，约时从中取出菌液于管，利用菌液进行初步鉴定是否连接成功，剩余菌液置于摇床摇过夜，后用于提取质粒。菌液鉴定方法将收集的菌液放入离心机，弃上清。用双蒸水重悬，并置于沸水中。反应体系及条件如表和表。表菌液鉴定体系试剂含量氯化镁缓冲剂酶引物上游下游经处理的菌液双蒸水表菌液鉴定条件温度时间预变性变性退火延伸个循环延伸重组质粒的鉴定及保存从上述于摇床摇过夜的菌液中提取质粒，并经过纯化试剂盒纯化后，送往上海生物技术工程有限公司进行测序，进步鉴定连接是否成功，同时将获得的连接克隆质粒进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳法检测是否连接成功。最终将连接正确的菌液及质粒经处理后置于冰箱保存。稳定高表达的细胞株的建立细胞的复苏万方数据分类号密级公开硕士学位论文可溶性促进对肿瘤细胞的免疫杀伤活性实验研究学位申请人杜玮学科专业妇产科学指导教师李志英教授刘朝奇教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文。
3、色液称取考马斯亮蓝粉末于干净烧杯，加甲醇，冰醋酸，并加入定容至，充分混匀，完全溶解，经滤纸过滤后，保存。称取粉末有毒，注意戴口罩，溶于，移至水浴完全溶解，加入将总体积调定至，并调节溶液的酸碱度至，置室温条件下，保存备用。酚氯仿取适量苯酚利用的平衡后，加入等体积氯仿，充分混匀，避光棕色瓶密封覆盖适量保存。实验方法质粒的扩增感受态的构建于冰箱中取出大肠杆菌菌种，冰置分钟，利用接种环稀疏划线接种于不含抗性的固体培养皿，培养皿倒置于保温箱，过夜。在无菌条件下，从培养皿中挑取单菌落到装有培养液的管中，放置于摇床，过夜。取出呈浑浊悬浮状的菌液，接种于装有无菌培养液的培养瓶中，置于摇床约。利用多功能荧光酶标仪测菌液值约为时，转移至预冷的圆底离心管，冰置，移至离心机中。在无菌的环境中，弃上清，并用预冷过的氯化钙重悬，在冰盒中静置半个钟头，移至离心机中。重复步骤。在无菌环境中，用预冷的重悬，加入的无菌甘油混匀，分别取分装于无菌管，速冻后置冰箱保存。转化质粒于冰箱取出感受态及所需转化的质粒，冰置。将混匀的质粒加入感受态中，冰置。将上述混合物于水浴中快速加热，然后快速冰置。在无菌条件下，将加入经上述处理的感受态中。将混匀的感受态移至摇床中培养约。万方数据三峡大学硕士学位论文在无菌条件下将上述培养液涂布于预热的相应抗性的培养皿中，置于培养箱，过夜。碱裂解法小量质粒的提取在无菌条件下挑取转化的单克隆至无菌的含有相应抗性的培养液中，置于摇床，过夜。取混匀的菌液。
4、原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的本课题主要研究宫颈癌细胞中的高表达与的相关性并探讨通过阻断信号途径，以及协同基因对肿瘤的特异性杀伤淋巴细胞发生抑制作用的影响时，使肿瘤特异性淋巴细胞的生物学功能得以恢复的功能作用。方法利用流式细胞术检测本实验室已建立的稳转细胞株中的表达水平。利用技术克隆获得人的目的基因，并构建真核表达质粒。将鉴定构建成功的真核表达质粒转染人宫颈癌细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性克隆，并进行扩大培养后，利用及免疫荧光技术鉴定在细胞中的稳定表达。使稳转的克隆细胞与从人脐带。
5、的纯化方法按纯化试剂盒随附的说明书，逐步操作。重组质粒的构建目的基因片段的克隆以质粒为模板，利用设计的引物，通过的方法获得目的基因。反应条件及体系见表和表。上游引物下游引物万方数据三峡大学硕士学位论文其中上游引物含有限制性内切酶的酶切位点，下游引物含有限制性内切酶的酶切位点。表反应体系试剂含量氯化镁缓冲剂酶引物上游下游质粒双蒸水表反应条件温度时间预变性变性退火延伸个循环延伸将经上述反应所获得的基因目的片段，经的琼脂糖凝胶电泳检测分析。琼脂糖凝胶的配制方法正确称量所需浓度的琼脂糖粉末，称量时注意调零。佩戴手套，利用单蒸水清洗模板及锥形瓶，将量取的适应量的液及琼脂糖粉末混合加入锥形瓶，并置于微波炉中加热，使琼脂糖粉末完全融化，待冷却后加相应量的，混合均匀后迅速倒入模板，待凝胶冷却凝固成型。表琼脂糖凝胶配方浓度琼脂糖凝胶粉末溶液溴化乙锭孔孔孔孔孔孔万方数据三峡大学硕士学位论文电泳仪检测方法将配制好的琼脂糖凝胶放入电泳仪器槽中，加入适量的液，将适量样本加入相应琼脂糖凝胶中，电泳仪电压设置为，电流设置为，时间设置为。真核表达质粒的构建质粒的纯化将获得的质粒质粒图谱见图经过质粒扩增并提取到高浓度的质粒，然后利用质粒纯化试剂盒对质粒进行纯化。同时将经方法获得的目的基因片段经过切胶回收并用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化。将经上述处理后的质粒和目的基因片段利用琼脂糖凝胶电泳对其鉴定分析。图质粒图谱质粒的酶切将纯化的质粒和目的基因片段，按照表的体系进行双。
6、浴，经的灭活，并于超净台内过滤除菌后方可加入相应的培养液使用。细胞冻存液将无菌的或小牛血清或胎牛血清二甲基亚砜按照的比例在超净台内混合均匀，置于无菌的管中，保存。封闭液利用稀释的浓度为。准确称取于烧杯，加入，充分混匀，完全溶解，保存。溶液将溴化乙锭用完全溶解，混合均匀，避光，保存。称取粉末，加入中，充分溶解并混合均匀，经高压灭菌，保存。称取粉末充分溶解于中，分装后保存，在常温取用后若未用完要及时放入保存，避免长菌。细胞裂解液先用约加热溶解放入烧杯中，加入，溶解后加入定容至，混合均匀备用，用之前加入的蛋白酶抑制剂。万方数据三峡大学硕士学位论文无菌量取管超净台分装保存。显影液液，液，液，加定容至，室温避光保存。考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝粉末于干净烧杯，加甲醇，冰醋酸，并加入定容至，充分混匀，完全溶解，经滤纸过滤后，保存。称取粉末有毒，注意戴口罩，溶于，移至水浴完全溶解，加入将总体积调定至，并调节溶液的酸碱度至，置室温条件下，保存备用。酚氯仿取适量苯酚利用的平衡后，加入等体积氯仿，充分混匀，避光棕色瓶密封覆盖适量保存。实验方法质粒的扩增感受态的构建于冰箱中取出大肠杆菌菌种，冰置分钟，利用接种环稀疏划线接种于不含抗性的固体培养皿，培养皿倒置于保温箱，过夜。在无菌条件下，从培养皿中挑取单菌落到装有培养液的管中，放置于摇床，过夜。取出呈浑浊悬浮状的菌液，接种于装有无菌培养液的培养瓶中，置于摇床约。利用多功能荧光酶标仪测菌液值约为时，转移至预。
参考资料：
1、该PPT不包含附件（如视频、讲稿)，本站只保证下载后内容跟在线阅读一样，不确保内容完整性，请务必认真阅读。
2、有的文档阅读时显示本站（www.woc88.com）水印的，下载后是没有本站水印的（仅在线阅读显示），请放心下载。
3、除PDF格式下载后需转换成word才能编辑，其他下载后均可以随意编辑、修改、打印。
4、有的标题标有”最新”、多篇，实质内容并不相符，下载内容以在线阅读为准，请认真阅读全文再下载。
5、该文档为会员上传，下载所得收益全部归上传者所有，若您对文档版权有异议，可联系客服认领，既往收入全部归您。
解读《中国交通的可持续发展》白皮书PPT讲稿 编号18060