国家自然科学基金刺梨白粉病抗性候选基因的克隆申请书 ㊣ 精品文档 值得下载

对高抗株系进行扩增，回收特异带，然后对其进行连接并转化到感受态的大肠杆菌上，获得转化的克隆储藏备用克隆的测序和序列分析将获得的克隆进行测序，然后通过和其他已知的抗病基因进行对比，并通过蛋白质序列分析软件包进行蛋白质结构预测和特性分析，粗选出可能的后选基因遗传相关性分析以高抗类型极感病类型及其代遗传群体为试材，按抗性的大小，将代群体里的极端类型高抗和极感类型标出，连同双亲共个类型。

每个类型株左右，取相同量的叶片混合后抽提，构建基因池。

再将回收出的后选基因片段转成探针，对上述基因池进行分析，根据双假测交原理，采用方法，确定片断和白粉病抗性的遗传关系刺梨基因组的文库的构建文库筛选以通过检验的与抗病相关的扩增片段制备探针，采用高密度菌落原位杂交法筛选刺梨的文库，将阳性的克隆进行亚克隆，并将亚克隆再与扩增产物杂交，获得阳性亚克隆。

亚克隆序列分析将阳性亚克隆有选择地进行测序，并与其他植物已分离抗病基因进行比较分析，研究抗病基因在不同植物中的结构差异及进化关系。

将分离到的部分亚克隆连接到植物表达载体上，为鉴定候选基因的功能抗病性及转化感病品种奠定基础。

技术路线流程引物设计，特异抗病类型感病类型分离有性杂交，获得代群体组建基因池，分离以回收片段为探针，进行分析克隆片段与抗病性遗传关系的分析特异片段的回收克隆测序序列分析文库构建文库筛选，获得阳性克隆亚克隆测序比较分析可行性分析本研究旨在以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用植物大部分抗病基因编码蛋白质所具有的保守结构域，设计特异简并引物对进行，分离和克隆抗病候选基因。

这种方法已在拟南芥水稻大豆小麦番茄及柑桔等植物中得到成功应用。

同源序列克隆与结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。

同时通过刺梨的白粉病高抗和极感株系杂交产生的后代，运用双假测交原理，采用法，确定克隆出的与刺梨白粉病抗性的遗传关系。

申请人已在作物遗传改良国家重点实验室从事了两年的分子生物学研究工作，并已获得了代杂交种子，课题旦获得立项，其分子生物学研究内容将在国家重点实验室进行，申请小组已具备课题顺利实施的物质和技术基础。

课题的创新之处图位克隆和转座子标签法费时长且极为昂贵，在木本植物上尚未见成功的报道。

刺梨遗传基础研究十分薄弱，但杂交座果率高种子多，建立遗传群体相对容易。

申请小组拟采用大部分已知抗病基因所共有的保守结构域设计特异简并引物对，通过扩增，可以在缺少遗传物理图谱的情况下，对我国珍稀果树刺梨进行白粉病抗性候选基因的克隆。

同源序列克隆与相结合，可以找出与白粉病抗性紧密连锁或共分离的后选基因，然后再通过筛选文库可望克隆全长的基因同时，该连锁关系的确定还将为刺梨遗传图谱的进步构建奠定基础。

年度研究计划及预测进展年以设计简并引物，进行特异，特异带的回收及克隆，测序及序列分析文库的构建基因池的构建及的分离。

年以回收片段为探针进行分析采用法分析克隆片段与抗病性的遗传关系性。

如果获得资助，我与本项目成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。

申请者签章年月日九推荐意见不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。

推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础研究能力科研态度及研究条件等，项目组成员不能做推荐者十申请者所在单位及合作单位的审查与保证申请者所在单位学术委员会的审查意见包括对项目的意义特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见主任或副主任签章年月日合作单位的具体意见与保证同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持督促其按计划完成所承担的任务及需要说明的其他问题合作单位公章合作单位公章合作单位公章申请者所在单位领导的审查意见与保证已对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见并保证在项目获得后做到以下几点保证对研究计划实施所需的人力物力和工作时间等条件给予支持严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理财务等各项规定督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料需要说明的其他问题无单位负责人签章单位公章年月日文库筛选，获得阳性克隆。

年亚克隆，测序及序列的比较分析植物表达载体的构建论文撰写及课题的鉴定验收。

预期研究成果克隆出刺梨白粉病抗性后选基因确定与刺梨白粉病抗性连锁或共分离的分子标记建立刺梨文库表达质粒载体的构建在国内外刊物上发表较高水平的论文篇。

四研究基础与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩从年月起，在国家自然科学基金其他项目和贵州省自然科学基金的资助下，申请小组借助作物遗传改良国家重点实验室依托单位华中农业大学的实验条件，已开展了年多的前期工作，取得了以下进展建立起刺梨及其近缘种的分离技术及实验体系完成了刺梨及其近缘种的分析，刺梨主要栽培类型指纹图谱的构建，并撰写论文篇，已投通过高抗类型和重感类型的有性杂交，获得了代种子建立起刺梨特异实验体系完成了简并引物对设计，引物对筛选及特异带的寻找工作初步完成了特异带的回收，获得了部分克隆申请小组已具备该项目顺利实施的技术储备。

已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径包括利用国家重点实验室和部开放实验室的计划与落实情况申请人从年起，在作物遗传改良国家重点实验室攻读在职博士学位。

申请项目旦立项，全部分子生物学工作将在作物遗传改良国家重点实验室开展，实验室拥有较好的分子生物学实验条件和技术平台，无须添置大型仪器设备就能保证项目的顺利实施。

申请者和项目组成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及其在本项目中承担的任务青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位论文作者题目刊名年份卷期页码专著作者书名出版者年份五经费预算支出科目金额万元计算依据及理由科研业务费资料复印论文印刷，学术会议，旅差费，零工实验材料费分子生物学试剂引物合成及，回收及克隆，测序，酶，同位素，尼龙膜，其他分子生物学试剂电泳试剂琼脂糖进口，等其他易耗品胶卷，培养皿，试管，三角瓶，试剂瓶，管酒精，液，抽提试剂，如苯酚氯仿等仪器设备费移液枪各支实验室改装费协作费国家重点实验室台面费，协作单位管理费项目组织实施费合计注预算支出科目按下列顺序填写科研业务费实验材料费仪器设备费实验室改装费协作费项目组织实施费。

开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。

六申请者正在承担的其他研究项目攀登计划计划攻关任务和各部委省市任务等项目的名称及编号任务来源起止年月负责或参加以及与本申请项目的关系等情况七申请者承担负责或参加国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况对申请者的前个已结题科学基金资助项目项目名称及批准号完成情况后续研究进展及与本申请项目的关系加以说明。

另附该已结题项目研究工作总结摘要字及已发表主要相关论文首页复印件限三篇。

八申请者承诺我保证上述填报内容的真研究，。

但是，对生长周期长树体高大很多种类自交不育的果树来说，要构建代群体绝非易事，目前仅在桃上有采用代进行的报道，。

实际上，绝大多数果树栽培品种为杂合体，许多基因位点都会在自交或杂交中分离，采用双亲都为高度杂合的品种或株系杂交，其杂交代性状分离复杂，产生双假测交现象，利用其代群体，应用法可以直接进行果树的基因定位卢江，。

该方法已在苹果柑桔等遗传背景复杂的多年生果树上得到成功应用，。

在植物白粉病抗性基因的克隆上，前人取得了很大进展。

等采用图位克隆法分离出大麦白粉病抗性基因等采用同源序列法分离出拟南芥白粉病广谱抗性基因而通过设计简并引物的策略，在大豆上克隆出与大豆白粉病抗性连锁的类共个候选基因，为基因的全序列克隆奠定了基础，。

这表明，基于的同源序列法有可能分离出植物的白粉病。

本研究拟以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用大多数植物抗病基因所具有的结构特征，设计特异简并引物对进行，分离和克隆候选基因。

同源序列克隆与结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。

通过刺梨的白粉病高抗和极感株系的杂交后代，采用法，由此确定克隆出的与刺梨白粉病抗性的遗传关系。

并以与刺梨白粉病抗病紧密连锁或共分离的转化为探针，筛选文库，以期获得完整的基因。

课题的实施，对刺梨白粉病抗性候选基因的获得，分子标记辅助选择抗病类型具有重大意义，并为最终获得完整的抗病基因及进步开展重要性状的遗传定位奠定坚实的物质和技术基础。

主要参考文献朱维藩等贵州的刺梨资源及其生长发育含量同生态条件关系的调查究。

贵州农学院丛刊，。

庞纯翠等刺梨白粉病的发生发展极其防治的研究。

贵州农学院丛刊，。

向显衡等贵州省刺梨种质资源利用研究。

中国水土保持，。

卢江基因定位极其在园艺作物遗传育种中的应用。

园艺学年评，。

科学出版社。

史继孔等我国刺梨研究进展。

贵州农学院学报，。

樊卫国等贵州省刺梨资源开发利用及对策。

西南农业学报，。

薛永彪等水稻基因组中类抗病基因同源序列的分离。

科学通报，。

贺超英等大豆中类抗病基因同源序列的分离与鉴定。

科学通报，。

董继新等植物抗病基因研究进展。

植物病理学报，。

郑先武等水稻类基因同源序列。

中国科学辑，。

，，，，，，，，，，，，三研究方案研究目标研究内容和拟解决的关键问题研究目标克隆条左右后选基因片段，测定其序列确定克隆出的后选基因与白粉病抗性的关系建立刺梨