1、准适用于结球白菜和不结球白菜常规种子杂交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。农作物种子检验规程发芽试验农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定术语与定义下列术语和定义适用于本文件。标记,简单重复序列,又称短串联重复序列或微卫星序列,它是类以冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,加等体积超纯水。反应程序参数反应程序参数见表。表反应程序参数程序反应温度时间循环数预变性,个循环降落变。
2、不同品种引物位点差异,判定两个品种为相近品种引物位点差异,判定两个品种为疑同品种。对相近品种和疑同品种,利用供检样品与标准样品的个引物位点的指纹谱带数据进行比较引物位点差异,判定两个品种为不同品种引物位点差异,判定两个品种为近似品种引物位点差异,判定两个品种为相同品种或极近似品种。附录规范性附录所用溶液的配置方法提取溶液的配制称取羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水中,加蒸馏水定容至,高压灭菌。称取乙胺乙酸钠盐,约需颗粒,加蒸馏水定容至,高压灭菌。十烷基硫酸钠称取十烷基硫酸钠缓慢加入到蒸馏水中,边加列参见附录。操作步骤纯度检测样品的提取使用种子直接提。
3、丙烯酰胺。,亚甲基双丙烯酰胺。苗作为试样,进行幼苗培养。按照附录规定的方法提取样品。扩增反应体系反应的总体积为,反应体系见表。白菜品种纯度及真实性分子检测方法。,放入离心机中离心。每管取上清液,里面预先放入缓冲液,混匀,稍做离心后,作为下步或扩增的模板,或放入冰箱备用。白菜基因组提取方法,每管加入提取液及少量石英砂,用尖头玻璃棒碾碎,混匀。水浴锅中水浴,水浴过程中混匀次。,每管加入饱和酚氯仿异戊醇混合液,混匀,离心。,加入体积预冷的异丙醇,体积的乙酸钠溶液,混匀,冰箱放置,充分沉淀。离心沉淀列参见附录。操作步骤纯度检测样品的提取使用种子直。
4、品种纯度及真实性分子检测方法。表反应体系试剂终浓度体积超纯水缓冲液氯化镁溶液引物溶液酶模板总体积备注如果缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,加等体积种子检验规程发芽试验农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定术语与定义下列术语和定义适用于本文件。标记,简单重复序列,又称短串联重复序列或微卫星序列,它是类以的短核苷酸序列为基本单位串联重复状分布于整个基因组内的重复序列。标记,内部简单重复序列,是利用包含重复序列并在端或端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用引物来扩增重复序列之间的区域。聚合酶链式反应,种用于在体外扩增序列的。
5、菜品种纯度检测常用的引物名称及序列参见附录。白菜真实性鉴定常用的引物名称及序列参见附录。操作步骤纯度检测样品的提取使用种子直接提取进行检测的样品数量,按照,从送检样品中随机数取粒种子作为试样使用幼苗提取进行检测的样品数量,按照,从净种子中随机数取定数量种子保证株幼苗作为试样,进行幼苗培养。按照附录规定的方法提取样品。扩增反应体系反应的总体积为,反应体系见表。表。每管加入乙醇,离心,清洗,清洗过程重复次。室温晾干,加入缓冲液充分溶解,稍做离心后,作为下步或扩增的模板,或放入冰箱备用。白菜基因组提取方法使用商品化的植物基因组提取试剂盒,进行白。
6、进行检测的样品数量,按照,从送检样品中随机数取粒种子作为试样使用幼苗提取进行检测的样品数量,按照,从净种子中随机数取定数量种子保证株幼苗作为试样,进行幼苗培养。按照附录规定的方法提取样品。扩增反应体系反应的总体积为,反应体系见表。表反应体系试剂终浓度体积超纯水缓冲液氯化镁溶液上下游引物溶液酶模板表反应体系续试剂终浓度体积总体积备注如果缓仪器设备及耗材仪器设备天平。水浴锅。微波炉额定功率。酸度计。磁力搅拌器。高速台式离心机。高压灭菌锅。冰箱最低温度。微量加样枪,,。扩增仪。紫外成像仪。紫外分光光度计。水平仪。高压电泳仪额定功率。电泳槽。白菜。
7、,退火,延伸,个循环,退火温度每循环下降扩增变性,退火,延伸,个循环最终延伸,个循环保存,无限长个循环注使用不同的扩增仪,应对仪器进行调整。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录规定的方法,进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。真实性鉴定样品的提取使用种子直接提取进行鉴定的样品数量,按照,从送检样品和标准样品中各随机数取粒种子作为试样使用幼苗提取进行鉴定的样品数量,按照,从净种子和标准样品中各随机数取定数量种子保证株发布实施北京市质量技术监督局发布目次前言范围规范性引用文件术语与定义原理仪器设备及耗材试剂和溶液配制引物选用原则及筛选方法操作步骤。
8、检测结果附录规范性附录所用溶液的配置方法附录资料性附录白菜品种纯度检测常用的引物名称及序列附录资料性附录白菜真实性鉴定常用的引物名称及序列附录规范性附录白菜基因组提取方法附录规范性附录变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法附录规范性附录非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法前言本标准按照给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位北京市种子管理站。标准主要起草溶液配制倍变性加样缓冲液量取甲酰胺甲苯青,混匀。当自行筛选适宜真实性鉴定的引物时,应遵循扩增后的电泳谱带多态性高,条带清晰。
9、接提取进行鉴定的样品数量,按照,从送检样品和标准样品中各随机数取粒种子作为试样使用幼苗提取进行鉴定的样品数量,按照,从净种子和标准样品中各随机数取定数量种子保证株幼苗作为试样,进行幼苗培养。按照附录规定的方法提取样品。扩增反应体系反应的总体积为,反应体系见表。表反应体系试剂终浓度体积超纯水缓冲液氯化镁溶液引物溶液酶模板定适宜的引物。自行筛选用于真实性检测的引物时,选取有代表性的常规种子或杂交种种子粒粒及至少个以上不同品种。利用系列引物进行试验,根据扩增后的常规种或杂交种电泳谱带多态性高,条带清晰重复性好的原则,确定适宜的引物。核心引物库白。
10、菜单粒干种子或单株幼苗基因组的提取。质量检测质量检测方法将提取的白菜样品适当稀释,用紫外分光光度计在波长和波长处测定并记录其紫外光吸收率,质量好的样品溶液。质量检测方法在琼脂糖凝胶中,每个提取样品加入约样品,的条件下电泳,加染色。提取质量好的样品应是条没有拖尾的亮带,提取质量较差的样品有拖尾现象,靠近胶底部的亮带是白菜品种纯度及真实性分子检测方法.人田雷赵山普贾希海赵青春彭瑞迪王辉福德平高勇张连平黄寰。白菜品种纯度及真实性分子检测方法范围本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。本标。
11、技术程序。模板基因序列先经高温变性成为单链,在聚合酶的作用和适宜的何倍数扩增。引物在合成反应时,提供末端作为合成的起点,能够与模板特定区域特异结合的多核苷酸单链。原理简单重复序列和内部简单重复序列广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点的重复单位或序列会因为品种的不同而存在遗传结构上的差异,这些差异表现为多态性。针对重复单位或序列的不同,设计相应的引物和引物,通过技术进行扩增电泳染色,形成白菜品种的和指纹图谱,进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。异戊醇。异丙醇。无水乙醇。种脱氧核糖核苷酸,缩略为。聚合酶。缓冲液。标准分子量标记。引物。引物。。
12、重复性好的原则。引物筛选方法自行筛选用于品种纯度检测的引物时,选取有代表性的杂交种种子粒及父母本种子各粒。利用系列引物进行试验,根据扩增后的杂交种电泳谱带含有双亲互补带型,条带清晰重复性好的原则,确定适宜的引物。自行筛选用于真实性检测的引物时,选取有代表性的常规种子或杂交种种子粒粒及至少个以上不同品种。利用系列引物进行试验,根据扩增后的常规种或杂交种电泳谱带多态性高,条带清晰重复性好的原则,确定适宜的引物。核心引物库白菜品种纯度检测常用的引物名称及序列参见附录。白菜真实性鉴定常用的引物名称及指纹谱带数据进行比较引物位点差异,判定两个品种为。
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DB11T 829-2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法