提高体系的浸润性和细菌的洗脱效果，但也没有获得满意的效果。

方案中采用了热的高浓度，短时间作用，达到了种的有效差分，的提高了，说明这处理方法使细菌的拷贝数明显下降，而的相对比例也有所提高，者的差异扩大了近倍。

为了进步验证溶液中处理的时间对细菌清除效果的影响，在的基础上，分别延长到和，其他实验步骤不变。

结果显示，当处理时间延长到时，其中个样本的和均无数值显示，另外两组，的的值分别达到和，的值分别为和，较处理相比，分别提升了和，这说明将温度提升到时，此方法对细菌和的影响基本相致，还可能导致提取失败。

当处理时间延长到时，在洗脱过程中，磁珠由原来的分散状态转变为凝聚状态，反复震荡也无法分散，使后续步骤无法进行。

所以，就目前的方案而和方案溶菌酶方案和方案处理的毛干样本，细菌的含量没有明显降低。

用的溶液处理毛干样本方案，可把的拷贝数降低近倍，而动物的拷贝数没有明显降低。

四种毛干提取细菌清除方法对比分析遗传工程论文。

不同处理方法对细菌清除效果的定量检测引物和的熔解曲线如图所示，它们的熔点峰值分别为和左右，熔解曲线峰值点高度重合，且仅有个峰值点，说明引物无聚体，无非特异性扩增及其他外源污染，引物设计完全符合实验要求，保证实验结果的真实性。

图蓝狐毛干在种方法处理下和细菌的扩增产物的电泳图图引物和的熔解曲线采用荧光定量检测发现，未经处理的毛干样本中提取的四种毛干提取细菌清除方法对比分析遗传工程论文速拿出，用去离子水冲洗遍。

移入新管，以乙醇浸泡保存备用。

为了进步验证溶液处理的有效性，增加两组实验，将处理时间从延长到和，其他处理过程不变，样本分别标记为，。

的提取在超净工作台内，将毛发样品取出室温下放臵以上，使乙醇自然挥发。

转至的无菌离心管内，按原样编号。

用剪刀把样品剪碎，每个试管中加入缓冲液，蛋白酶和，稍微震荡混匀，水浴中消化后，再加入的蛋白酶，继续消化，随后使用动植物基因组磁珠法提取试剂盒中科雷鸣，中国北京进行提取，具体操作步骤见说明书。

摘要毛发无根作为种非损伤性的生物样本，在保和细菌丰度的变化为了检测不同处理方法对细菌清除的效果，以动物的和细菌的质粒为目标，通过相对荧光定量方法分别测定相对值。

的扩增引物和的扩增引物仍采用前述引物。

为了提高扩增的特异性，将都提升到。

者的扩增体系和扩增条件相同。

四种毛干提取细菌清除方法对比分析遗传工程论文。

细菌的清洗用型电子天平，美国称份毛发样品，每份，分别移入个无菌的离心管中。

本实验使用种不同的处理方法来处理毛发样本，每种处理方法做个重复，标记为，最后组作为对照组，清洗之后未加处理。

毛干操作步骤如下。

取溶液和溶液加入试管中，短暂震荡下放臵以上，使乙醇自然挥发。

转至的无菌离心管内，按原样编号。

用剪刀把样品剪碎，每个试管中加入缓冲液，蛋白酶和，稍微震荡混匀，水浴中消化后，再加入的蛋白酶，继续消化，随后使用动植物基因组磁珠法提取试剂盒中科雷鸣，中国北京进行提取，具体操作步骤见说明书。

细菌的清洗用型电子天平，美国称份毛发样品，每份，分别移入个无菌的离心管中。

本实验使用种不同的处理方法来处理毛发样本，每种处理方法做个重复，标记为，最后组作为对照组，清洗之后未加处理。

毛干操作步骤如下。

取溶液和溶液摘要毛发无根作为种非损伤性的生物样本，在保护遗传学和分子生态学研究中发挥着十分重要的作用。

以毛干中提取的为模板做扩增时，片段扩增效果较好，但核基因的扩增成功率极低。

人们将其归因于核质低量少所致。

然而我们在前期研究中发现，从毛干中得到的总混有大量的细菌，是导致核基因扩增困难的主要因素之。

为此我们尝试建立种高效快速低成本，而且不影响提取的清除毛干细菌的方法。

本研究以蓝狐被毛为材料，经过普通清洗后，以种方法处理毛干，随后使用磁珠法进行总提取，并通过荧光定量检测总中细菌的含量，以此评估种方法的有效性。

结果表明，未经处理的毛干样本总中，和细菌的值分别为和佳处理时间在左右。

虽然未对温度进行梯度测试，但也不推荐使用以上的高温，避免强碱对毛干和的降解作用过于激烈。

另外，本研究仅测试了蓝狐的毛干，包括针毛和绒毛。

但是，哺乳动物毛发结构和化学组成大同小异，应该具有普遍意义。

而鹿科动物的毛干属于薄壁中空的结构，承受强碱作用的能力较低，作用时间可能更要缩短，需要另行摸索。

参考文献徐怀亮，汪宴廷，姚永芳，等藏酋猴毛干的种提取方法东北林业大学学报，安丽媛，洪宇，徐友宣人体毛发中类固醇类兴奋剂的液相色谱串联质谱检测方法研究中国运动医学杂志，张浩，陈彩珍，乔华浅析毛发分析法在兴奋剂检测中的作用山西师大体育学院学报，增刊仲光启，由玉岩，徐艳春，等黑鹳微卫星位点的筛选及遗传特点分析野生动物学报，姚无法进行。

所以，就目前的方案而言，最佳处理时间为左右即可。

图种处理方法与对照组和的值的比较讨论由于毛干具有稳定的化学结构取材便利及易保存等特点，人们将其视为获取动物的重要来源。

很多文献报道使用从毛干中提取的做扩增时，实验结果大都不尽人意，尤其是扩增的成功率极低。

虽然人们从提取方法扩增条件等方面进行优化，但也难以获得有效提升，。

本研究首先评估了毛发经过普通清洗后样本，获得的总可以同时扩增出和细菌的目的片段，显示者同时存在图。

荧光定量的检测显示，和的均值分别为和，者的比值为。

说明细菌的数量与动物的相差不未经处理的毛干样本中提取的总中，与细菌的值分别是，其比值为。

以这比值为基准评估不同方法清洗后质粒的数量变化。

结果显示，在常温下经过和双重处理溶菌酶处理以及处理，样品中的值分别为和的值为和。

与的值之比均接近对照组的水平，分别为和。

这表明这种处理方法都未能有效洗脱毛发上的细菌。

当把样品在的中保留，和的值分别为和分别为，者之间的比值为，情况的主要原因还是在于提取效率低下。

我们改进了提取方法，从毛干中得到的可用于微卫星等核基因的分析另文报道，但是无法用于基因组的测序。

主要原因是毛干中混有大量的细菌，其数量远远超过动物。

这些细菌主要来自毛发表面和经断裂处进入髓质的环境细菌。

只要有效去除细菌，有效富集动物，就可以在高通量测序中获得足够的动物序列。

去除细菌可以有两种途径是把毛发在提取之前彻底清洗，去除细菌是在获得之后，把细菌分离出去。

第种途径通常采用甲基化抗体包被的磁珠，特异性地吸附甲基化丰富的动物，而不吸附甲基化缺乏的细菌，从而达到分离目的。

但是这方法方面费用十分昂贵，另方面，操作过程涉及多次移液，会损失大量的动物四种毛干提取细菌清除方法对比分析遗传工程论文军，熊克扬，刑佳鑫，等江西汉族人群个常染色体位点的遗传多态性中国法医学杂志，凃政，陈松，李万水，等脱落毛发及毛干的分型研究刑事技术，陈松，胡兰低拷贝模板分型及其存在的问题中国法医学杂志，邓建强，刘宝琴，蔡继峰，等两种全基因组扩增技术对单根毛发检验效能的研究中国热带医学，管政，刘金钏，周宇，等毛干的快速提取及其对的影响安徽农业科学，张瑚敏，杨朝国检测结核分枝杆菌中不同细菌裂解方法结果观察川省卫生管理干部学院学报，张林，武红艳，王克杰，等单根毛发分型方法的改进中国法医学杂志，周永恒，马跃，崔靓玉，徐艳春，杨淑慧毛干提取中种细菌清除方法的比较研究野生动物学报，基金国家重点研发计划项目种的有效差分，的拷贝数下降了个数量级而使动物成为优势图。

以上结果说明，第，细菌对毛干的黏附力很强，采用洗衣粉溶液阴离子去垢剂和碱液等般的方法无法彻底清除第，细菌的裂解比较困难，溶菌酶等温和条件不能达到满意效果，只有通过热的强碱溶液才能裂解，并从毛干上脱落下来。

然而，延长强碱的处理时间从延长到和未能获得更好的效果，相反，还严重影响了提取效率，甚至引发了磁珠的凝聚。

推测可能有两个原因，是在较高温度下延长作用时间之后，强碱破坏了毛干结构并进入毛干，裂解了残存的是强碱进入毛干后，在下游的漂洗步骤中不能有效漂洗出来，强碱被带入磁珠捕获步骤，改变了磁珠表面性质，引发凝集。

综上所述，采用热的强碱溶液可以有效清除毛干上的细菌，时度进行梯度测试，但也不推荐使用以上的高温，避免强碱对毛干和的降解作用过于激烈。

另外，本研究仅测试了蓝狐的毛干，包括针毛和绒毛。

但是，哺乳动物毛发结构和化学组成大同小异，应该具有普遍意义。

而鹿科动物的毛干属于薄壁中空的结构，承受强碱作用的能力较低，作用时间可能更要缩短，需要另行摸索。

参考文献徐怀亮，汪宴廷，姚永芳，等藏酋猴毛干的种提取方法东北林业大学学报，安丽媛，洪宇，徐友宣人体毛发中类固醇类兴奋剂的液相色谱串联质谱检测方法研究中国运动医学杂志，张浩，陈彩珍，乔华浅析毛发分析法在兴奋剂检测中的作用山西师大体育学院学报，增刊仲光启，由玉岩，徐艳春，等黑鹳微卫星位点的筛选及遗传特点分析野生动物学报，姚军，熊克扬，刑佳鑫，等江西汉族多。

因为比低至少个数量级，所以如果细菌在总中占优势，的扩增效率就会受到显著影响。

因此在提取之前清除细菌是非常必要的。

我们以样本为基准测试了种处理方案的效果。

方案中采用去垢剂和处理，期望通过阴离子表面活性剂和共同对细菌进行裂解，但是和的拷贝数并未发生差分。

方案中采用溶菌酶来裂解细菌，达到消除的目的。

但是虽经长时间的作用，也没有把和的拷贝数进行有效差分，说明溶菌酶的作用效率不高。

方案中采用了非离子表面活性剂提高体系的浸润性和细菌的洗脱效果，但也没有获得满意的效果。

方案中采用了热的高浓度，短时间作用，达到了的值有明显变化，平均提高了，说明这处理方法使细菌的拷贝数明显下降，而的相对比例也有所提高，者的差异扩大了近倍。

为了进步验证溶液中处理的时