测定牛排产品中大豆蛋白含量利用液相色谱-串联质谱法的研究（分析化学论文） ㊣ 精品文档 值得下载

筛选出的大豆定性多肽列表。

目前缺少大豆蛋白定量的准确方法，在牛排定级上也存在定的困难，因此，有必要建立适用于牛排产品中大豆蛋白含量测定的方法。

传统的蛋白分析方法主要为凯式定氮法。

在待测对象中，当大豆蛋白和其他动物蛋白或者植物蛋白成分混合在起时，需要对不同蛋白成分进行区分。

岳巧云等采用实时聚合酶链式反应，法，以大豆内源基因为参照基因，按比例混合奶粉和含大豆蛋白的配方营养粉进行测定，可以判断奶粉中是否掺入了豆粉。

许息其次利用液相色谱串联质谱对大豆蛋白特异性多肽进行确证，构建大豆蛋白定性判别方法进步开展用于定量多肽的筛选研究，最终筛选到线性和回收率较好的定量多肽共条，分别为，线性相关系数均达到以上，加标回收率为，精密度小于，检出限为，定量限为同时对市售个牛排进行大豆蛋白含量的测定，构建方法测定牛排中大豆蛋白含量的方法。

结果表明，该方法特异性好，准确度高，同时可推广应用至其他肉制品。

关键词分析测定牛排产品中大豆蛋白含量利用液相色谱串联质谱法的研究分析化学论文上的保留时间离子化和质谱响应等都有明显差异，因此需要开展适用于上特异性多肽的挑选，需要满足以下条件每个多肽母离子下子离子不少于个母离子和子离子响应较高。

按照此条件，共挑选出大豆定性多肽个，多肽信息见表。

以挑选出的多肽为例，相对分子质量为，带个正电荷，母离子，挑选出个子离子，分别为，见图。

表筛选出的大豆定性多肽列表图多肽提取离子流图大豆蛋白定量多肽的筛选肉制品中添加的大豆蛋白越多，大豆蛋白含量越高，意味着合后的样品按照前处理方法，选择表中的条多肽进行测定，采用标准曲线定量计算加标回收率。

表中的个多肽，部分多肽回收率太高，超过，有些回收率太低，低于，多肽计算的回收率为，精密度小于，见表，证明该个多肽用作定量具有较高的准确度和稳定性，使用该方法能够较可靠地测定牛排样品中大豆蛋白含量。

表个定量多肽的回收率和精密度综合以上结果，最终确认用于大豆蛋白定量的多肽为。

测定牛排产品中大豆蛋白含量谱分析条件色谱柱流动相为甲酸水，相为甲酸乙腈洗脱程序流速柱温进样量。

标准曲线目前没有大豆蛋白定性定量的标准物质，选择肉制品加工常用的大豆分离蛋白纯度在以上作为标准物质，称取大豆分离蛋白按照节方法，以大豆蛋白的质量作横坐标，表筛选的条多肽的峰面积作纵坐标，分别构建相应的线性曲线，排除线性关系系数小于的多肽，见表。

以大豆多肽为例，以大仪器与设备液相色谱高分辨质谱配有电喷雾离子源及数据处理系统以及软件联用仪配有电喷雾离子源数据处理系统美国公司往返式水浴恒温摇床上海智诚分析仪器制造有限公司液氮冷冻研磨仪上海净信发展有限公司离心机日本公司。

方法样品前处理称取样品精确至，放臵离心管中，加入缓冲盐提取液，尿素溶液硫脲溶液，打开液氮，冷冻研提取的多肽响应值大部分都高于缓冲液，因此，尿素硫脲组合的提取溶剂为最佳选择。

本研究采用高灵敏度高扫描速度的高分辨质谱系统鉴定大豆蛋白，通过比较和分析寻找其特异性多肽，通过数据库进步筛查确认，以及系统验证，筛选大豆蛋白特异性强稳定性好的多肽，并确证可用于定量分析的多肽，拟建立套用于大豆蛋白定性定量分析的方法，以期实现对于牛排产品中大豆蛋白含量的测定。

材料与方法材料与试剂牛排市购大豆分离蛋白豌豆蛋白玉米蛋白花生蛋白小麦酸均为生化级美国公司甲酸乙酸乙腈均为色谱纯德国科技公司固相萃取柱，美国公司尿素硫脲盐酸碳酸氢铵均为国产分析纯。

牛肉大豆蛋白的混合体系参照牛排通用的生产工艺，构建牛肉大豆蛋白的混合体系，大豆蛋白含量根据实验内容适当调整，其他成分按照牛肉水淀粉聚磷酸盐盐比例混合备用。

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数据分析通过软件找出大豆物种的专属性多肽链，将多肽序列列表导入到反应过夜。

放臵室温后，加入氟乙酸溶液终止反应，准备上样。

依次用乙腈乙腈溶液乙酸溶液活化固相萃取柱，全部溶液上样，再依次用水，乙酸溶液淋洗，最后用乙腈乙酸∶，洗脱，过滤膜，待测。

液相色谱高分辨质谱分析条件色谱柱流动相为甲酸水，相为甲酸乙腈洗脱程序流速柱温进样量。

本研究采用高灵敏度高扫描速度的高分辨质谱系统鉴定大豆蛋白，通过比较和分析寻用作定量具有较高的准确度和稳定性，使用该方法能够较可靠地测定牛排样品中大豆蛋白含量。

表个定量多肽的回收率和精密度综合以上结果，最终确认用于大豆蛋白定量的多肽为。

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胰蛋白酶测序级硫苏糖醇生化级美国公司碘乙酰胺氟乙酸均为生化级美国公司甲酸乙酸乙腈均为色谱纯德国科技公司固相萃取柱，美国公司尿素硫脲盐酸碳酸氢铵均为国产分析纯。

牛肉大豆蛋白的混合体系参照牛排通用的生产工艺，构建牛肉大豆蛋白的混合体系，大豆蛋白含量根据实验内容适当调整，其他成分按照牛肉水淀粉聚磷酸盐盐比例混合备多肽的峰面积代入对应大豆蛋白多肽的回归方程，得到相应大豆蛋白的质量为，待测样品中大豆蛋白质量分数按下式计算公式结果与分析前处理的优化提取溶剂的选择不同提取溶剂提取出的蛋白种类和数量不同，需优化提取溶剂以最大化地提取蛋白。

种常见蛋白的提取溶剂分别为缓冲溶液尿素溶液缓冲溶液尿素溶液硫脲溶液。

考察种溶剂对大豆蛋白中大豆专属多肽的提取效果，由图可知，缓冲液能够将大豆蛋白的条多肽全部提取出来，而缓冲液对多肽等提取效率比较低。

对比缓冲液可以发现，缓冲选择肉制品加工常用的大豆分离蛋白纯度在以上作为标准物质，称取大豆分离蛋白按照节方法，以大豆蛋白的质量作横坐标，表筛选的条多肽的峰面积作纵坐标，分别构建相应的线性曲线，排除线性关系系数小于的多肽，见表。

以大豆多肽为例，以大豆蛋白质量计分别为，峰面积分别为，其构建的线性方程为。

筛选的条多肽主要来源于件，获得每个多肽链的母离子和子离子碎片信息，并将离子信息导入中，开展扫描，通过对比每组离子对的保留时间响应强度等信息，对特异性离子对进行筛查，以确定定性离子信息。

标准曲线的制作称取精确至大豆分离蛋白按照节前处理方法，第步离心后，分别取，质量浓度以大豆蛋白质量计，对应的质量分别为，进行后续的实验操作，待测溶液进分析。

以大豆蛋白的质量作横坐标，筛选的大豆蛋白多肽峰面积作纵坐标，计算回归方程。

检测结果计算待测样品的称样量为，将待测样品各个找其特异性多肽，通过数据库进步筛查确认，以及系统验证，筛选大豆蛋白特异性强稳定性好的多肽，并确证可用于定量分析的多肽，拟建立套用于大豆蛋白定性定量分析的方法，以期实现对于牛排产品中大豆蛋白含量的测定。

材料与方法材料与试剂牛排市购大豆分离蛋白豌豆蛋白玉米蛋白花生蛋白小麦蛋白北京美添前景科技有限公司大豆分离蛋白大豆浓缩蛋白山东万得福实业集团有限公司生鲜牛肉来自屠宰场。

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方法样品前处理称取样品精确至，放臵离心管中，加入缓冲盐提取液，尿素溶液硫脲溶液，打开液氮，冷冻研磨，次后，离心。

取上清液，放臵离心管，加入硫苏糖醇溶液，振荡反应，降至室温后加入碘乙酰胺溶液，暗处反应向上述反应体系中加入，然后加入胰蛋白酶大豆的主要蛋白。

其中蛋白与等筛选的大豆蛋白的结果相符。

表线性关系系数大于的多肽列表回收率结果参照混合不同含量的大豆蛋白，将混合后的样品按照前处理方法，选择表中的条多肽进行测定，采用标准曲线定量计算加标回收率。

表中的个多肽，部分多肽回收率太高，超过，有些回收率太低，低于，多肽计算的回收率为，精密度小于，见表，证明该个多肽测定牛排产品中大豆蛋白含量利用液相色谱串联质谱法的研究分析化学论文图多肽提取离子流图大豆蛋白定量多肽的筛选肉制品中添加的大豆蛋白越多，大豆蛋白含量越高，意味着大豆多肽含量越高。

但考虑到多肽种类繁多，酶解过程复杂，影响因素较多，并不是所有特异性多肽的含量与蛋白含量呈正相关，因此需要开展定量多肽的筛选。

定量多肽需要具备两大特征，第是可以构建较好的线性关系相关系数不应低于，第是能够满足方法构建需要的回收率。

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标准曲线目前没有大豆蛋白定性定量的标准物质伟设计了大豆蛋白的特异性引物和探针，构建了鉴别牛肉制品掺假大豆方法。

但技术也存在定问题，如易受复杂基质干扰加工过程易降解等。

通过软件分析，并搜索数据库确认，发现大约多肽是大豆特异性多肽。

将这些多肽序列导入到软件，可转化成离子对信息，再将离子对信息导入到，参照节方法分析。

是针对靶标分子的种质谱分析技术，该技术采用重极杆质谱仪，检测靶标分子的母离子和子离子的质谱响应信号，从而获取较灵敏学多肽大豆蛋白定量液相色谱串联质谱牛排牛排起源于西方国家，是历史悠久的西式菜肴。

近年来我国人民生活水平提高，牛排产品市场快速增长，据行业统计，目前规模以上牛排生产企业已达余家，牛排的产量也快速增长。

目前市售的预包装牛排以牛肉为主料，同时添加淀粉大豆蛋白等改善牛肉风味。

不同工艺的牛排价格差异显著，等级也不同，目前牛排等级划分主要依据蛋白含量。

大豆蛋白成本低，加入定量的大豆蛋白，可以提高蛋白含量，但有些商贩虽然加入了大豆蛋白，但