双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理二新生链的荧光标记原理早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在自动测序中得到广泛应用二新生链的荧光标记原理•荧光染料标记法单色荧光标记法多色荧光标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法荧光标记引物法荧光标记终止底物法二新生链的荧光标记原理多色荧光标记法荧光标记引物法定义将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的端组种荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同测序反应中，模板反应底物聚合酶及标记引物等按编号被置于支微量离心管中，四个测序反应分管进行，上样时合并在个泳道内电泳。

特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系二新生链的荧光标记原理•荧光标记引物法荧光标记引物法原理二新生链的荧光标记原理多色荧光标记法荧光标记终止底物法定义将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上反应中将种分别用种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的在掺入片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了种特定的荧光染料经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息二新生链的荧光标记原理模板产物新生链的荧光标记原理二新生链的荧光标记原理荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点•都确定了种荧光染料与种所终止的片段之间的专对应关系•荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有定间隔•荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为，两者在同时间完成•在具体操作中，前者要求四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同管中完成二新生链的荧光标记原理单色荧光标记法•也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法•与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳二新生链的荧光标记原理单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点•均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法•单色荧光标记法需将四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳•多色荧光标记引物法需将四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同泳道中电泳•多色荧光标记终止底物法可将四个反应在同扩增管中进行，电泳时在同泳道中电泳三荧光标记的检测原理测序反应般以单引物进行聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳两极间极高的电势差推动着各个荧光液基因分析仪的基本结构二仪器各组成部分的功能主机功能具有自动灌胶进样电泳荧光检测等功能自动进样器区功能自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样电极和毛细管在电极缓冲液瓶洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成二仪器各组成部分的功能电极为电泳的负性电极，测序过程中，正负极之间的电势差可达伏，如此高的电势差可促进分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度片段的目的样品盘有孔和孔两种，可次性连续测试或个样本电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。

二仪器各组成部分的功能凝胶块区功能注射器驱动杆给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中。

在分析每个样品前，泵自动冲掉上次分析用过的胶，灌入新胶样品盘按钮控制自动进样器进出注射器固定平台起固定注射器的作用电极为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中二仪器各组成部分的功能正极缓冲液阀当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液电泳时此阀打开，提供电流通道玻璃注射器储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力毛细管固定螺母固定毛细管废液阀在清洗泵块时控制废液流。

二仪器各组成部分的功能检测区功能激光检测器窗口及窗盖激光检测器窗口正对毛细管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。

电泳时，当荧光标记链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到摄像机上同步成像。

窗盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄二仪器各组成部分的功能加热板电泳过程中起加热毛细管的作用，般维持在毛细管为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动热敏胶带将毛细管固定在加热板上。

激光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱测序图测序图二仪器各组成部分的功能微型计算机功能控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分析。

设置测序条件样品的进样量电泳的温度时间电压等，同步监测电泳情况并进行数据分析各类软件功能承担数据收集序列分析及片段大小和定量分析等功能。

其结果可由彩色打印机输出三全自动测序仪的常见故障及维护毛细管电泳型测序仪平板电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流电极弯曲电泳时产生电弧其他电泳时仪器显示无电流传热板粘住胶板其他毛细管电泳型测序仪的常见故障及维护•电泳时仪器显示无电流电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管电极弯曲而无法浸入缓冲液中毛细管未浸入缓冲液中毛细管内有气泡等•电极弯曲安装调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中运行前未将样品盘归位或虽然执行了归位操作，但轴归位尚未结束就运行轴归位等毛细管电泳型测序仪的常见故障及维护•电泳时产生电弧主要原因是电极加热板或自动进样器上有灰尘沉积•其他测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管定期清洗泵块定期更换电极缓冲液洗涤液和废液管二平板电泳型测序仪的常见故障及维护•电泳时仪器显示无电流电泳缓冲液配制不正确电极导线未接好或损坏正极或负极铂金丝断裂正极或负极的胶面未浸入缓冲液中•传热板粘住胶板主要原因为上方的缓冲液室漏液二平板电泳型测序仪的常见故障及维护•其他倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板配制凝胶时应注意胶的浓度含量尿素浓度等倒胶时需注意不能有气泡将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素冲去，以免影响电泳效果四全自动测序仪的进展等于年首次建立了种使用四种不同荧光分别标记四种不同碱基的方法同年，建立了种使用单色荧光四甲基罗丹明作为标记染料的自动测序方法平板法电泳是经典的电泳技术，具有样品判读序列长块凝胶板上可同时进行多个样品测序可达个的优点毛细管电泳为近年来建立的种快速高效进样量少灵敏度高的新技术，可测序列达到左右四全自动测序仪的进展单色荧光标记四色荧光标记平板型电泳毛细管电泳芯片实验室缩微生物处理器，成功完成纳升级标本的测序四全自动测序仪的进展缩微生物处理器结构示意图第十四章全自动测序仪和蛋白质自动测序仪内容提要第节全自动测序仪工作原理双脱氧链末端终止法测序原理二新生链的荧光标记原理三荧光标记的检测原理二全自动测序仪的结构与功能仪器的组成二仪器各组成部分的功能内容提要三全自动测序仪的常见故障及维护毛细管电泳型测序仪的常见故障及维护二平板电泳型测序仪的常见故障及维护四全自动测序仪的进展五全自动测序仪的主要应用第二节蛋白质自动测序仪蛋白质测序仪的工作原理二蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能三蛋白质测序仪的主要应用前言了解生命现象解释疾病的发生诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象前言核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构核苷酸的线性排列构成它的级结构蛋白质的级结构是指构成蛋白质的基本单位氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的级结构是了解蛋白质功能的基础第节全自动测序仪测序核苷酸序列早期小片段重叠法通过测定序列来推测序列缺点既费时又不准确世纪年代以后自动测序仪双脱氧链末端终止法化学降解法优点操作简单安全快速准确全自动测序仪工作原理双脱氧链末端终止法化学降解法都是根据在固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在个特定的碱基处终止，产生四组不同长度的系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得序列双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动测序仪中应用广泛双脱氧链末端终止法测序原理利用的体外合成过程聚合酶链反应，聚合酶的催化以目的为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下单核苷酸聚合形成新链双脱氧链末端终止法测序原理•普通的反应体系中，加入的核苷酸单体为种脱氧核苷三磷酸，结构示意图双脱氧链末端终止法测序原理•测序反应体系中，加入的核苷酸单体为，双脱氧核苷三磷酸结构示意图双脱氧链末端终止法测序原理与相比，在脱氧核糖的位置上缺少个羟基，反应过程中虽然可以在聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的链的末端脱氧核糖发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到链中，但它们本身没有，不能同后续的形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的链在此终止。

双脱氧链末端终止法测序原理据此原理分别设计四个反应体系，每反应体系中存在相同的模板引物四种和种如，则新合成的链在可能掺入正常的位置都有可能掺入而导致新合成链在不同的位置终止。

由于存在与的竞争，生成的反应产物是系列长度不同的多核苷酸片段。

双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理二新生链的荧光标记原理早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在自动测序中得到广泛应用二新生链的荧光标记原理•荧光染料标记法单色荧光标记法多色荧光标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法荧光标记引物法荧光标记终止底物法二新生链的荧光标记原理多色荧光标记法荧光标记引物法定义将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的端组种荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同测序反应中，模板反应底物聚合酶及标记引物等按编号被置于支微量离心管中，四个测序反应分管进行，上样时合并在个泳道内电泳。

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