来实现的。漆酶催化个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还原为水。还原性底物结合于位点，从中提取个电子，该电子通过途径传递到三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧，接受的电子，并传递给氧，使之还原为水。漆酶底物的专性漆酶的作用底物具有较大的广谱性，初步统计，漆酶催化氧化不同类型的底物已达个，而且还有增加的趋势，底物结构大致可归纳如下酚类及其衍生物如，二甲氧基酚，愈创木酚等。这类底物最容易被氧化芳胺及其衍生物如邻联茴香胺。这类化合物结构与酚类相似，比较容易被氧化羧酸及其衍生物如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化些人工合成的化合物如等非酚类化合物也可以作为漆酶的底物金属有机化合物这类底物主要有二茂铁类化合物其它化合物这类底物主要包括苯环上连有轻基烷氧基氨基氯代化合物及多环稠环化合物杂环化合物等。第页共页漆酶的应用漆酶作为种高效，绿色的催化剂，随着固定化技术的不断发展，扩大了漆酶的工业应用范围和前景，固定化酶在废水处理，生物传感器，食品行业方面中有着重要的应用价值。废水处理的应用造纸工艺中需要去除木质素，传统高温蒸煮去除木质素的纸浆得率低且污染环境，而漆酶能选择性地催化木质素降解的这个特性可用于纸浆生产，减少环境污染，杜绝废水。这是漆酶最有前景的应用。漆酶还可用作纸浆的生物漂白。漆酶来源广泛使用方便，降解木质素效率高，固定化后能更有效的发挥作用。目前，漆酶介导系统己经得到了实际应用。食品工业中的应用在饮料方面的应用除去啤酒和果汁等饮料原料中的酚，提高啤酒质量和透明度。另外，漆酶还在食品分子的交联改善生面团的性质增加酱油风味去除食品异味等工艺中发挥着重要作用。在食用菌和药用菌方面的应用在食用菌制种过程中加入漆酶制剂能加速木质素的分解，能为菌丝提供更丰富的养料，加快菌丝吃料，缩短培养时间。利用这种方法培养木耳香菇等将有益于节约成本和扩大生产规模。环境保护中的应用去除氯酚类有机化合物很多研究表明，漆酶具有转化酚型底物的能力，其中包括氯酚甲基酚甲氧基酚等。在底物聚合过程中，有氯离子从溶液中被释放出来，这表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。染料降解在印染和造纸等工业过程中，大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问题之。白腐菌漆酶具有广泛的底物专性，可以氧化芳香环化合物，对纺织染料的脱色及降解效果明显。生物检测中的应用漆酶在催化过程中消耗氧气，这过程很容易被转化为电信号而高灵敏地得到检测。在免疫检测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有如下几个优点氧气作为第二底物，不形成非产物型的酶底复合物相比于过氧化物酶，漆酶对介质中不同价态的金属离子浓度的敏感性较低无需特殊的仪器和试剂。同时由于漆酶能够催化多种酚类物质生成酚类化合物，固定化漆酶电极作为生物传感器在酚类物质的检测中应用广泛。第页共页第章材料和方法实验材料与仪器菌种木蹄层孔菌东北林业大学遗传学实验室提供实验材料试剂马铃薯葡萄糖琼脂麦麸玉米木屑可溶性淀粉麦芽糖酵母汁蛋白胨牛肉膏柠檬酸柠檬酸钠缓冲液的酒精表微量溶液的配制药品含量次氮基三乙酸酯表液体培养基配制药品含量白桦木屑酒石酸铵第页共页琥珀酸二甲酯微量元素硫胺素实验仪器紫外可见分光光度计恒温箱烘箱高压湿热灭菌锅干热鼓风超净台可调控温度摇床冰箱刀锅电磁炉打孔器镊子三角瓶烧杯容量瓶棕色试剂瓶移液枪离心管高速冷冻离心机离心机磁力搅拌器酸度计。实验方法木蹄层孔菌的培养培养基在烧杯中加入蒸馏水，将土豆去皮切成的小方块。去除掉虫蛀和坏的，称取土豆料放入纱布中包好，再讲纱布放入烧杯中，将烧杯置于沸水中煮，拿出烧杯，将纱布挤干，再称取葡萄糖加入土豆汤中，用蒸馏水定容至，加入适当琼脂左右，用封口膜封口备用。活化菌种在微波炉中溶解土豆培养基，移入超净工作台，将培养基分装在灭菌的培养皿中，等其形成固体后，再分别接上菌种。接菌完成后，用封口膜封好连接口，移入恒温培养箱培养，温度设定为，在无光条件下培养天，每天观察菌的生长情况。配制液体培养基，接菌培养配制液体培养基表，将配制好的液体培养基平均分配到三角瓶中，每瓶中加入培养基。在超净工作台上将活化好的菌种接到液体培养基中，每瓶培养液中用打孔器打入个菌饼进行培养，为测酶活做准备。粗酶液的制备第页共页取培养天的培养物，分别加入个的离心管中离心，弃沉淀，取上清液，此即为测酶活所用的粗酶液。漆酶酶学性质在大离心管中依次加入的酒石酸钠，的，蒸馏水，酶液预热后取加入到离心管中混匀，转移到比色皿中在波长下进行吸光光度值的测定，计算酶活。不同温度对漆酶的影响和漆酶的热稳定性最适酶活温度将酶和的缓冲溶液蒸馏水分别在入个菌饼进行培养，为测酶活做准备。粗酶液的制备第页共页取培养天的培养物，分别加入个的离心管中离心，弃沉淀，取上清液，此即为测酶活所用的粗酶液。漆酶酶学性质在大离心管中依次加入的酒石酸钠，的，蒸馏水，酶液预热后取加入到离心管中混匀，转移到比色皿中在波长下进行吸光光度值的测定，计算酶活。不同温度对漆酶的影响和漆酶的热稳定性最适酶活温度将酶和的缓冲溶液蒸馏水分别在的温度下预热后混合测酶活，共个处理，每个处理个重复，取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶的最适酶活温度。最佳耐受温度将酶和的缓冲溶液蒸馏水分别在下进行预热，共个处理，每个处理个重复，各处理，处理完毕迅速放入冰里，混合然后在测酶活。其中三组设定的对照。不同对漆酶的影响和漆酶的稳定性最适将酶液分别和值的缓冲溶液蒸馏水分别在预热，混合测酶活，共个处理，每个处理个重复，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶酶活最大时候的最适值。耐受将酶液分别和为的缓冲溶液蒸馏水水浴后混合测酶活，共个处理，每个处理个重复，其中三组设定的对照，温度为，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶耐受的范围。不同金属离子对漆酶的影响除了底物外，反应体系酒石酸钠酶液金属离子和抑制剂混合在预热后混合测酶活。金属离子和抑制剂加蒸馏水，金属离子和抑制剂加蒸馏水，以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，测定各金属离子对漆酶酶活力的影响。漆酶酶促动力学即酶促反应达到最大半反应速率时的底物浓度。在最适和最适温度下，测定在不同第页共页浓度时的酶活。做出的酶促动力学曲线，计算酶活。数据统计和分析根据查证，漆酶酶活的计算公式如下酶的活性单位ε和ε。酶的活性单位式中，为每分钟吸光度净增或净减的数值ε为摩尔消光系数ε为毫摩尔消光系数为反应液的总体积为样品的体积。反应体系中稀释后的酶液为，的柠檬酸缓冲液为，的溶液，蒸馏水。于处测定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即测定，测定漆酶与底物反应的吸光度。以同体积的蒸馏水为对照组。已知处摩尔消光系数ε。第页共页第章结果与分析最适反应值及稳定性图体系值对酶活力的影响图酶的稳定性在相同温度下，漆酶相对酶活随的变化如图所示，漆酶的最适反应值为。漆酶的第页共页耐受如图所示。当低于的时候，漆酶的酶活极低处理时，为和时酶活都较高，处理后酶活仍能保持在。处理时，当大于，酶活降级较快。故在为的时候，漆酶的酶活最稳定。最适温度及热稳定性图温度对酶活力的影响图酶的热稳定性如图所示，在反应温度为的时候，酶活最高，故酶的反应最适温度为。在相同下，漆酶温度的耐受性见图。处理时酶活力最高次之，而酶活损失半多基本丧失。处理时漆酶耐受性最好，同时发现处理和处理的漆酶第页共页酶活相差很小。因此可知该酶热稳定性较差，温度低于还较稳定，高于就基本失活。金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响表激活剂和抑制剂对漆酶活力影响抑制剂种类不同浓度抑制剂作用下的相对活力图金属离子对酶活影响如图所示，的这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，其中对漆酶酶活的抑制作用最强，对漆酶酶活的抑制作用般。时，的抑制作用最弱。激活剂和抑制剂对酶活影响如表所示，均对漆酶的酶活性有着抑制作用，其中的抑制作用最强。对酶活有激活作用。第页共页图漆酶图米曼氏方程双倒数图由图得出，当的浓度为时，漆酶的吸光度数值为最高。此时酶活为。根据图双倒数图公式，计算得。第页共页第章讨论白腐真菌木蹄层孔菌漆酶酶活的温度和耐受实验表明，木蹄层孔菌产漆酶的最佳培养温度为，温度过高则会引起漆酶减产，超过漆酶酶活丧失。漆酶在温度为的时候酶活最高，但时间久了酶活会逐渐丧失。故测定漆酶酶活最佳温度为。随着温度的升高，漆酶的酶活下降很快，所以持续的高温会严重影响漆酶的酶活性。对漆酶的耐受和最适反应实验表明，当反应体系的为的时候，漆酶的酶活最高。当培养体系的为的时候，漆酶的酶活最稳定。随着的波动，酶活的衰减并不严重，所以对漆酶酶活的影响系数不大。种不同的金属离子对两种漆酶的活性影响表明的这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，对漆酶酶活的抑制作用般，其中对漆酶酶活的抑制作用最强，这可能是因为它占据了底物与酶的结合位点酶的活性中心，改变了酶的构象，从而使酶活性受到了明显的抑制由于这种离子对漆酶的活性中心均有毒害作用，在应用漆酶时应避免在溶液中加入这种离子。时，的抑制作用最弱。，而，对两种漆酶均有激活作用，这与是很多氧化还原酶的催化激活剂的特性比较致，而漆酶也是种氧化还原酶对漆酶有激活作用与是漆酶的个活性中心，也是漆酶分子的个重要组成成分的特点致。第页共页致谢本文是在导师尚洁讲师悉心指导下完成的。尚洁老师平易近人，指导认真负责，经常在实验室亲自指导我的实验，解答各种疑问。实验虽然简单，但其中数据的获取耗费了大量的时间，总共跨度达到三个月，在此期间尚洁老师直给我们指导，帮我们答疑解惑，才使得我们的实验能顺利完成。毕业论文定稿前尚洁老师每次修改都认真负责，小到标点符号的，大到文章的整体布局和数据的处理，她都会提出需要改进的地方。在此对尚洁老师的悉心指导表示衷心的感谢,第页共页参考文献程东升两类木蹄层孔菌在酶蛋白水平上的遗传分化苗物系统中国科普博览,方积年木蹄层孔菌多糖的研究现状药学通报黄益丽层孔菌属多糖的生物活性生命的化学陈洁木蹄层孔菌多糖的提取工艺及免疫活性研究广州南方医科大学,刘量,郑维发,周守标木蹄层孔菌乙醇提取物体内抗肿瘤活性及其对荷瘤鼠免疫功能的影响徐州医学院学报刘量,郑维发,周守标木蹄层孔菌乙醇提取物对肿瘤细胞的抑制