1、剂离心管号下预冷丙酮硫酸钛浓氨水离心，弃去上清夜，留沉淀硫酸万方数据三峡大学硕士学位论文样品的提取和测定称取新鲜的植物组织于研钵放入少量石英砂，按照材料∶提取剂∶加入预冷的丙酮，研磨成匀浆并转入离心管离心，将上清液转入新的离心管中，该上清液即为样品提取液。取提取液，按表加入硫酸钛和浓氨水，混匀离心，弃上清，用丙酮反复洗涤沉淀。再向沉淀中加入硫酸，溶解后，转入容量瓶中，定容至测定波长下比色。结果计算植物组织中含量式中为标准曲线上查得样品中浓度为样品提取液总体积为测定时用样品提取液体积为植物组织鲜重。镉离子含量的测定用天平称取约样品于消化管中，加入硝酸，高氯酸，加盖放入石墨炉消解仪进行消解，消解温度设置为，消解至冒白烟，然。
2、，每组数据各设计了个生物学重复。胁迫芯片的制备实验试剂及仪器实验试剂实验仪器万方数据分类号密级硕士学位论文超积累型东南景天铜锌超氧化物歧化酶基因的功能分析学位申请人韩强学科专业生物化学与分子生物学指导教师何正权教授卓仁英研究员二五年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文摘要超积累型。
3、利用如下程序，个循环，并分析熔解曲线，对和目的基因进行扩增。超氧阴离子含量和过氧化氢含量的测定超氧阴离子含量的测定提取液的制备称取植物叶片放入预冷的干净研钵中，加入磷酸缓冲液，充分研磨直到得到满意的匀浆，在，下离心，将此次收集的上清液以，离心，再次收集上清液，第二次所收集的上清液为样品提取液。亚硝酸根标准曲线的制作吸取母液，在试管中分别稀释成和的标准稀释液。将蒸馏水和标准稀释液按照浓度梯度万方数据三峡大学硕士学位论文分别加入到号试管中，每管，其中号为蒸馏水，然后各管再分别加入磷酸缓冲液对氨基苯磺酸和萘胺各，置于显色，以号管作空白对照，分别测定其波长处吸光度值。以号管亚硝酸根离子浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。。
4、后赶酸至消解管内液体剩余冷却后，采用超纯水，少量多次洗涤定容至，上机备用，同时做样品空白。采用火焰原子吸收光度法测定镉元素的含量。通过上机浓度称样量和定容体积计算植物器官中的镉含量。流速的测定用的处理野生型和三个转基因型拟南芥植株，对照组不用处理，将对照组和处理组均置于，光照黑暗的环境中培养。将待测试样品从培养环境中取出，放入测试液中平衡。测试液。将平衡好之后的拟南芥根部固定在培养皿底部，加入新鲜的测试液，利用提前校正好的离子电极测量样品根尖的镉离子流速。校正液，。将电极移至距根尖约处，开始测定该位点镉离子流速，直至获得稳定的离子流速，每个样品约测量。利用旭月科技有限公司开发的软件网址万方数据三峡大学硕士学位论文计算实验结。
5、属对植物内酶活性的影响植物修复技术与超积累植物超氧化物歧化酶研究进展的分类及分布的作用机理的基因克隆与转基因方面的研究研究的目的与意义第二章材料与方法植物材料主要仪器设备试剂引物方法代转基因拟南芥纯合株系的筛选相对表达量的检测超氧阴离子含量和过氧化氢含量的测定超氧阴离子含量的测定过氧化氢含量的测定镉离子含量的测定非损伤微测胁迫芯片的制备实验试剂及仪器包含的提取万方数据三峡大学硕士学位论文实验步骤第三章结果与分析代转基因拟南芥纯合株系的筛选相对表达量的检测表型分析超氧阴司中国台式高速离心机，德国超低温冰箱，日本天平，干燥器蜀牛复日紫外可见凝胶成像仪，上海复日科技公司中国恒温水浴箱宁波天恒仪器厂中国济南海能石墨炉消解仪其它玻璃。
6、在拟南芥地上部分积累，积累量最大的转基因型拟南芥可能具有更强的吸收镉和耐镉的能力。对浓度的处理的转基因拟南芥进行基因芯片分析，通过基因表达差异分析筛选出部分氧化还原相关基因，主要包括过氧化物酶谷氧还蛋白家族细胞色素等，也包括过氧化氢酶过氧化物还原酶等与活性氧清除相关的基因。分析芯片中上述这些基因的表达模式，发现与野生型相比转基因拟南芥中氧化还原相关万方数据三峡大学硕士学位论文基因在胁迫时间周时普遍上调，转基因拟南芥中活性氧清除相关基因的上调，使转基因拟南芥具有更强的活性氧清除能力，从而表现出更强的抗氧化胁迫能力，提高了转基因拟南芥的耐镉能力。关键词铜锌超氧化物歧化酶非损伤微测技术活性氧解毒基因芯片万方数据三峡大学硕士学位论。
7、有种子的平板置于暗培养两天，随后转移到拟南芥培养室，培养天观察平板中萌发后的拟南芥幼苗，查看是否全部为抗性植株。将平板中全部表现为抗性的株系转移到营养土中培养光照黑暗。相对表达量的检测利用艾德莱公司的植物快速提取试剂盒分别提取野生型和转基因拟南芥植株的，然后再利用检测基因在野生型和转基因型拟南芥中的相对表达量。具体步骤如下向的离心管中加入和裂解液，混合均匀以备用取适量植物组织在液氮中研磨成细粉，再取约细粉转入到装有和的离心管中，用手剧烈震荡约，使植物组织充分裂解利用吸头吹打直到得到满意匀浆，可剪切降低粘稠度并提高产量将裂解产物，离心，收集上清液万方数据三峡大学硕士学位论文取适量的裂解上清液不可超过基因组清除柱的能力，将其转。
8、，而在转基因拟南芥中维持在较稳定水平，说明转基因拟南芥跟野生型相比具有更强的清除活性氧的能力。用浓度的处理天左右的拟南芥幼苗，并在，光照黑暗的环境中培养，利用非损伤微测技术检测其根尖分生区镉离子流速。结果显示，野生型和转基因拟南芥镉离子流都呈现较为稳定的内流趋势，其流速在到范围内变化。处理前后的平均流速分别为野生型为，转基因型为，转基因型为，转基因型为。收获水溶液浇灌两周的野生型和转基因型拟南芥地上部分，利用原子吸收光谱仪和火焰原子吸收光度法测定其地上部分镉离子含量。结果显示，处理后的野生型和转基因型拟南芥中镉离子含量明显高于处理前，非损伤微测结果中流速大的转基因型拟南芥中镉离子含量高于另外三个株系，说明镉离子在处理过程中。
9、器皿均经过硝酸浸泡小时以上。试剂反转录试剂盒购自上海罗氏制药有限公司上海，中国，硝酸优级纯购进自美国默克公司高氯酸优级纯购进自上海金鹿化工苯酚卡那霉素乙醇氯仿蛋白胨酵母提取物琼脂粉等试剂均购自鼎国公司北京，中国，化学药品为进口或国产分析纯。荧光定量试剂盒购进自万方数据三峡大学硕士学位论文公司大连，中国，植物快速提取试剂盒购自艾德莱生物技术有限公司北京，中国，重金属，由国家标准物质物中心处购得。引物实时定量基因引物拟南芥内参引物实验方法代转基因拟南芥纯合株系的筛选将前期收集的代转基因拟南芥的种子置于灭菌后的超净台中，用乙醇浸泡，再用无水乙醇洗涤，将种子冲洗至灭菌滤纸上并吹干将吹干后的种子洒在含有的抗生素的固体培养基平板上将撒。
10、量的测定取四支试管，按照的顺序编号，号管中加入蒸馏水作对照，号管中加入样品提取液三个重复，然后每个试管分别加入磷酸缓冲液盐酸羟胺，混匀后，于条件下静置，各管再分别加入对氨基苯磺酸和萘胺各，充分混匀后置于条件下显色，将号管作为空白对照，测定其在波长处吸光度值。实验数据处理按公式所示，利用标准曲线和所测得的值计算出样品中亚硝酸根的浓度，再按照公式计算出的浓度。利用标准曲线查得提取液总量含量样品重测定时提取液用量将式中计算所得的含量代入式中，即可算出含量。含量过氧化氢含量的测定标准曲线的制作取支的干净离心管，按照的顺序编号，并按照表所示依次加入试剂。待沉淀完全溶解后转入容量瓶中，定容至，测定波长下比色。表测定浓度标准曲线配置表试。
11、到个新的离心管。加入上清体积半的无水乙醇可能出现沉淀，不影响提取，吹打混匀，不离心将基因组清除柱放入收集管中，再将混合物加入基因组清除柱每次少于，可分多次加入离心，弃滤液将清除柱放入离心管中，加入裂解液离心，收集滤液，再加入倍滤液体积的无水乙醇可能出现沉淀，不影响提取，吹打混匀，不离心将混合物每次少于，可分多次加入加入吸附柱中并放入收集管内离心，弃滤液往吸附柱内加入去蛋白液，室温下静置离心，弃滤液再加入漂洗液确保已加入无水乙醇离心，弃废液，重复次将吸附柱放回空收集管，再次离心，除净漂洗液将吸附柱，放入新的的离心管中，在吸附膜中间加入预热可提高产量，在室温下静置离心。以野生型和转基因型拟南芥的逆转录产物为模板，以和和为引物，。
12、东南景天是我国衢州地区古老矿区发现的种新的镉超积累植物，从实验室前期完成的东南景天转录组数据中筛选出个和耐镉相关的基因，将该基因转入拟南芥中以研究其在植物镉胁迫耐受机制中的功能。转基因拟南芥超表达植株的获得已由本实验室前期工作完成，利用浓度为的卡那抗生素对前期收获的转基因拟南芥超表达植株代种子进行纯合体筛选。利用技术，以野生型拟南芥作对照，检测基因在纯合株系中的相对表达量。结果显示，该基因在纯合株系中均能正常表达，选取相对表达量最高的三个纯合株系用作研究材料。以水溶液浇灌生长致的野生型和转基因拟南芥，收获处理前处理周两周和三周时的叶片，测定其中的超氧阴离子和过氧化氢含量变化。结果显示，超氧阴离子和过氧化氢在野生型拟南芥中积。
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