1、研究的收缩中表明，和正常大鼠肝脏中相比，肝硬化大鼠肝脏中的表达明显增高，这与肝硬化门脉高压产生的机理密切相关。在肝纤维化进展过程中，的沉积为其发生发展的本质。肝纤维化时，激活的能分泌大量的，其中以Ⅰ型胶原为主。大量研究已证明肝纤维化后肝组织Ⅰ型胶原的沉积较正常肝组织增多，这是Ⅰ型胶原分泌增多以及降解障碍的结果，而代谢失调主要体现在上。转化生长因子,作为导致肝纤维化的种重要的细胞因子，其能促进肝纤维化的作用已被大量研究所证实。激活后的以及肝纤维化组织中的表达明显增高，这就意味着是肝纤维化的重要细胞因子。研究表明可能并不能直接促进的增值而导致肝纤维化，而是通过增加,的表达促进的增殖及增加对的生成阻止的降解。作为种的导致激活与增殖，促细胞有丝分裂重要的细胞因子，可以说是肝纤维化的始动因子，在肝纤维化的发生及进展中具有刺激特定细胞群分。
2、纤维化治疗的个新进展，尽管目前人们对已有定的了解，但由于和其功能的复杂性，现仍有很多未知领域，如促进肝纤维化的通道机制，促进激活的具体作用机制及肝外组织调解的表达等等，都有待我们进步去研究与探索。是否能成为治疗肝纤维化新的基因切入点还需要更多细胞学动物学及临床实验证实。技术是近年新兴的种基因干预手段，其机制是转录后水平的基因沉默，基因可以正常转录，但在转录后不能积累使得基因在转录后水平失活。作为种新的基因沉默技术已逐渐被人们认识和了解。目前对的研究主要体现在相关抑制剂等药物上，对于运用研究在中沉默的表达对肝纤维化的作用尚未见报道。本研究为证实与选择性抑制剂尼美舒利相比，是否能更有效地沉默中基因的表达，从在抑制的表达上减少的激活胶原合成以及的产生减轻肝纤维化。通过成功构建真核表达载体，运用脂质体转染法干扰大鼠肝星状细胞，使大鼠肝。
3、达均低于空白对照组和空载体组.，其中以在转然后小时最明显。不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响转然后小时小时及小时，三条质粒组及尼美舒利组中的表达低于空白对照组和空载体组.，其中以在转然后小时最明显。结论转染入大鼠肝星状细胞后可沉默基因的表达。可通过沉默的表达，减少大鼠肝星状细胞增殖胶原合成及的分泌。关键词环氧合酶肝星状细胞干扰,.，.,,.,...,..,..,,前言肝纤维化是指由各种原因如病毒感染炎症因子等引起的肝脏组织弥漫纤维化的种病理综合征。肝纤维化是各种肝病发展的共同最终归宿，其主要是细胞外基质,代谢失调导致异常沉积的结果。目前大量研究证实，在不同原因诱导的肝纤维化模型中，肝脏组织中的主要是由产生，在肝纤维化形成的过程中具有重要的意义。在肝组织中有两种存在方式静息的和活化的。在正常肝脏中，以静息状态存在，数目较少，。
4、和增殖的能力。正是通过促进分泌大量的导致的激活增值导致代谢失调从而促进肝纤维化的，作为激活肝纤维化进展的信号通路，在肝纤维化发生发展过程中具有重要的意义。是前列腺素内过氧化合成酶的种亚型。实验证明，在大部分正常组织特别是肝组织不表达，但在病毒性肝炎和肝硬化组织中的表达明显增高，通过系列途径参与肝纤维化的启动以及肝纤维化的进展。所有肝损伤必定有炎症反应的参与，而作为种重要的炎症介质，在肝脏炎症反应中发挥重要的作用，主要表现如下通过炎症反应直接参与肝纤维化的发生发展肝细胞受损后，通过旁分泌释放丝裂原作用于，使增殖刺激肝细胞通过生成些细胞因子如等促进的激活活化的又能通过自身分泌产生些如的细胞因子，激活静息的。等研究前列腺素,和前列腺素,在诱导人类增殖中的作用中表明，能上调的表达，并能与介导刺激人类的增殖。研究与肝纤维化的关系是研究肝。
5、分类号密级编号硕士学位论文靶向对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达的影响研究生姓名周旭指导老师姓名职称阳学风教授学科专业名称消化内科研究方向肝纤维化的防治年月南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学。
6、胶去离子水，混匀。分离胶去离子水.，混匀。称.溶于去离子水中，调节值到.，定容至，保存备用。.称.溶于去离子水中，调节值到.，定容至，保存备用。甘氨酸电泳缓冲液称.和甘氨酸溶于去离子水中，加入，调节值到.后定容至，常温保存。⑩转移缓冲液称.甘氨酸.和.溶于去离子水中，加入甲醇，定容至，常温保存。⑪溶液称.和.，搅拌混匀后，用去离子水定容至升，室温保存。⑫称取并将其溶于去离子水中，调节值到.后定容到，常温保存。⑬丽春红染色液丽春红粉末.溶于去离子水，醋酸，混匀后用去离子水定容至。⑭尼美舒利的配制配制尼美舒利母液浓度为.，称量尼美舒利.，溶于，充分溶解后，用高糖培养液稀释到，混匀后，.微孔滤器过滤除菌，要使尼美舒利工作液总的浓度小于，避光长期保存。⑮培养基胰蛋白胨酵母粉加入去离子水中混匀，调解值为.，定容。如配置固体培养基加入.的。
7、.参考文献.综述.硕士期间发表的文章致谢.主要英文缩略语索引缩写词英文全称中文全称环氧合酶肝星状细胞干扰平滑肌动蛋白转化生长因子信使核糖核酸逆转录聚合酶链反应纤维连接蛋白细胞外基质层连蛋白基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶抑制剂肌成纤维细胞血小板源性生长因子溴化乙锭四甲基乙二胺二甲基亚砜十二烷基磺酸钠吐温缓冲盐溶液乙二胺四乙酸互补二硫苏糖醇聚偏二氟乙烯双链碱基对三羟甲氧氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸磷酸盐缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳苯甲基磺酰氟三羟甲基氨基甲烷四甲基乙二胺靶向对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达的影响研究生周旭导师阳学风教授中文摘要目的研究对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达的调控作用。方法应用将三条不同的转染到大鼠肝星状细胞，荧光显微镜观察其转染效率，及验证真核表达载体。技术分别在转染后小时小时小时检测和尼美舒利对Ⅰ型胶原表达的影。
8、盒江苏碧云天生物技术有限公司南京金斯瑞生物科技公司合成脂质体转染试剂广州英韦创津公司胶片英寸柯达公司尼美舒利公司其他试剂国产分析纯表靶点序列及引物合成序列靶点引物靶点引物靶点引物.主要仪器培养箱公司超净工作台苏州安泰空气技术公司电子分析天平美国公司高速离心机德国公司卧式电泳槽北京六仪器厂垂直电泳仪及转膜系统美国公司凝胶成像分析系统美国公司型倒置光学显微镜日本公司荧光倒置式生物显微镜日本尼康公司超低温冰箱日本三洋公司制冰机上海基汇生物技术有限公司.主要试剂配制缓冲液.，.，.，混合后加入去离子水充分溶解，定容至，高压灭菌，冷却后保存。生长培养液高糖培养基，的胎牛血清，青霉素，链霉素，按比例配好后分装小瓶保存。冻存培养液高糖培养基，的胎牛血清按比例配好后保存。.胰蛋白酶胰蛋白酶粉.，.，.滤膜的微孔滤器过滤除菌，保存，长期保存。积。
9、位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日目录主要英文缩略语索引中文摘要前言.实验材料与方法.实验材料.实验方法实验结果转染效率.沉默效果不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响不同处理方式对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响讨论.结。
10、其增值和凋亡处于个动态平衡，能储存维生素分泌少量的，能保持生成和降解的动态平衡，维持肝脏正常的生理功能。各种刺激因子如炎症细胞因子内毒素等刺激肝组织后，能使发生表型转换，迅速被激活，而各种原因导致的肝纤维化都以为靶细胞，使其激活后参与肝纤维化的发展。激活后发生如下改变激活后的迅速增殖，导致维生素大量丢失激活的分泌大量的，除ⅠⅢⅥ型胶原，还能分泌纤维连接蛋白，层连蛋白等等。基质金属蛋白酶，的合成减少，并合成基质金属蛋白酶抑制剂从而使合成增加而降解则减少，导致的代谢失调活化的转换成肌成纤维细胞能分泌平滑肌动蛋白使细胞变得具有收缩性，的收缩为肝硬化门脉高压的发生奠定了病理生理学基础生成大量的细胞因子，维持的激活状态，进步促进肝纤维化的发生与发展。的表达标志着的激活，已有大量研究表明，激活的以及肝纤维化组织中能表达大量使具有收缩性的。。
11、响。结果荧光显微镜显示成功转染入大鼠肝星状细胞后，荧光显微镜下细胞中的细胞质可见绿色的荧光，的转染效率均可达以上。沉默效应显示三条在转染小时后均能抑制大鼠肝星状细胞的表达.，以的抑制效果最佳。显示在转染小时后能抑制蛋白的表达。不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响在转染小时后，及尼美舒利组中的表达低于空白对照组和空载体组.在转染小时及小时后，三条质粒组及尼美舒利组中的表达低于空白对照组和空载体组.，其中以在转染后小时最明显。不同处理方式对大鼠肝星状细胞表达的影响在转染后小时，各组的表达均无统计学差异转染后小时及尼美舒利组表达低于空白对照组和空载体组.转染后小时三条质粒及尼美舒利组的表达均低于空白对照组和空载体组.，其中以在转染后小时最明显。不同处理方式对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响在转染后小时小时小时及尼美舒利组Ⅰ型胶原的。
12、状细胞达到基因沉默的效果，观察活化指标，分泌指标Ⅰ型胶原肝纤维化指标的表达，了解其作用机制，为以为靶点动物学临床试验的肝纤维化基因治疗以及抗肝纤维化新药的开发奠定基础。实验材料与方法实验材料.细胞和主要试剂来源大鼠肝星状细胞购自中科院上海细胞生物所细胞中心，该细胞为大鼠株，具有活化的的表型菌种为大肠杆菌，菌株，为克隆的宿主菌，质粒.见图，均由长沙赢润生物公司提供真核表达载体由本项目组构建。靶点序列及引物合成序列见表。图.载体结构图高糖培养基美国公司胎牛血清杭州四季青生物公司及部分限制性内切酶公司质粒提取试剂盒胶回收试剂盒长沙赢润生物技术有限公司琼脂糖公司逆转录试剂盒公司提取试剂盒广州东盛生物科技有限公司溴化乙锭，华美生物工程公司抗美国生物公司考马斯亮蓝过硫酸铵上海生工生物工程有限公司，发光试剂盒北京天根生物技术公司凝胶配制试剂。
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