1、犕重复。犛犖犜犕取底物至试验板各孔中。室温感作,从底物加至第孔开始计时。犕加终止液至各孔中,加终止液的顺序与加底物的顺序相同,振荡混匀。犕将试验板置酶标仪下读值,用空气作空白对照终止液加完后,孔中,取被检血清至余下相应的孔中,份血清样品对应个孔。犕将试验板置振荡器上轻振,封板,感作。犕依据试验所需将浓缩的洗液用蒸馏水作倍稀释,稀释前浓缩的洗液中应不存在结晶体。犕迅速翻转试验板,将其中的液体弃至废液缸中,并在吸水纸上扣击试验板次,注意每次要扣击在吸水纸的干净区域上。然后用洗板机洗每孔洗液量为或手洗用移液器取洗液加入每个孔中试验板,共洗板次。最后次洗板后手洗试验板时在每次洗板后,在吸水纸上扣击试验板至无液体流出。犕取已稀释倍的结合物。

2、相同。犛犖犜附录犐资料性附录溶血素效价的确定图犐溶血素效价的测定犛犖然后加入相应的被检血清。在被检血清旁加虎红平板凝集抗原。用牙签搅动被检血清和抗原使之均匀混合,形成直径约的液区。轻微摇动,室温下于内观察结果,同时作阳性血清和阴性血清对照。每次操作以不超过份血清样品为宜,以免样品干燥而不易观察结果。结果判定当阴性血清对照不出现凝集,阳性血清对照出现凝集时,则试验成立,可以判定。否则试验应重做。在内出现肉眼可见凝集现象出现凝块或颗粒物者判为阳性,不出现凝集者判为阴性。出现阳性反应的样品,还应进行补体结合试验或其他适合的试验进行确证。缓冲平板凝集试验试剂和材料抗原按说明书使用,使用前置室温,并充分摇匀。用本标准方法和指定单位生产的布。

3、菌基因组提取试剂盒操作说明书提取模板,然后将其溶于中。引物引物序列及浓度见表。表犘犆犚引物序列及浓度引物序列引物浓度到。犕正式试验犕取稀释液至包被抗原的微量反应板和孔中。犕取稀释液至微量反应板和孔中。犕从参考血清稀释板中取已被稀释的血清移至微量反应板相应的孔中。犕取未被稀释的乳液样品至反应板相应的孔中。犕轻微振荡试验板,封板,感作。犕翻转试验板,将其中的液体弃至废液缸中,并在吸水纸上扣击试验板次,注意每次要扣击在吸水纸的干净区域上。然后用洗板机洗每孔洗液量为或手洗用移液器取洗液加入每个孔中试验板,共洗板次。最后次洗板后手洗试验板时在每次洗板后,在吸水纸上扣击试验板至无液体流出。犕取稀释的酶结合物加入试验板的各孔中,封板,感作。。

4、犡体对照溶血个单位补体对照和个单位补体对照溶血红细胞对照不溶血。表测定结果显示,抗原作稀释时阳性血清的效价最高,因此,以稀释的抗原做为试验用工作单位。犛犖犜附录犎资料性附录国际补体结合单位国际补体结合单位与血清效价的换算见式国际补体结合单位被检血清效价国际标准血清的效价国际标准血清是由生物制品标准化专家委员会制定,并规定每安瓿含有补体结合抗体。式中,国际标准血清的效价是用所使用的补体结合方法及试剂测定。例如按所使用的方法测定国际标准血清,其最终效价为抑制溶血,而同时测定被检血清的最终补体结合效价为,代入式则该被检血清的效价用国际单位表示为。用本标准的试剂和方法测定出的国际标准血清效价正好为,因此被检血清的国际单位数与血清稀释倍数。

5、抗体,血清样品中与抗原发生特异性结合的抗体与单克隆抗体竞争抗原上的同抗原决定簇,感作段时间后,再加入只识别单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记的结。缓冲液缓冲液电泳缓冲液溴化乙锭加样缓冲液,配制方法见附录。琼脂糖。试验用双蒸水符合中的级水。主要设备超净工作台或生物安全柜高速低温离心机台式小型离心机低温冰箱扩增仪电泳仪凝胶成像分析仪水浴锅旋涡振荡器。试验程序样品的制备标准菌株布氏杆菌培养物,接种环挑取个菌落于中。阴性对照菌株大肠杆菌培养物,接种环挑取个菌落于中。样品可疑布氏杆菌培养物,接种环挑取个可疑菌落于中。犇犖犃模板的提取将上述菌悬液在沸水中煮沸,离心,尽量倒尽上清液,所提取的模板溶于中。或将菌悬液直接离心,离心后弃去上清液,按细。

6、依据试验所需量将浓缩的结合物用稀释缓冲液作∶稀释至试验板的每个孔中,感作。犕重复。犕取底物至每个孔中,感作。犕取终止液至每个孔中。犕将试验板置酶标仪下读值,用空气作空白对照终止液加完后,内读值。犕判定当阳性对该被检血清的效价用国际单位表示为。用本标准的试剂和方法测定出的国际标准血清效价正好为,因此被检血清的国际单位数与血清稀释倍数相同。犛犖犜附录犐资料性附录溶血素效价的确定图犐溶血素效价的测定犛犖犜附录犑资料性附录补体效价的确定图犑补体效价的确定犛犖犜附录犓规范性附录抗原效价的测定表表犓方阵试验操作步骤抗原稀释度血清对照抗原对照补体对照红细胞对照抗原阳性血清阴性血清补体工作效价稀释液第次感作振荡致敏红细胞第次感作振荡注抗原对照为。

7、氏杆菌凝集抗原测定国际标准血清时,其效价正好为,因此本标准方法测定的被检血清的效价的倒数即为其国际单位数。例如本标准方法测定的被检血清最终效价为,则用国际凝集单位表示为犘犆犚反应体系不含氯化镁引物混合液犜犪狇聚合酶模板补足至反应总体积为。同时设立阳性对照阴性对照和空白对照,用布氏杆菌的标准菌株的模板作阳性对照,用大肠杆菌的标准菌株的模板作阴性对照,用水作空白对照。犘犆犚扩增产物电泳检测取琼脂糖,加入电泳缓冲液加热溶解,加入溴化乙锭至终浓度为,制胶,将的和扩增产物分别与适量的加样缓冲液混合,点样。恒压,电泳左右,凝胶成像分析系统检测并记录结果。结果判定除了空白对照,所有的扩增产物在处都有条带。如果条带没有出现则有可能是样品中含有。

8、的补体用量为个单位补体。犡滴定前补体稀释倍数测出的个单位补体用量正式试验时每管补体用量式中犡配制个单位补体所需补体原液的稀释倍数。校正计算见式在试验中发现补体在感作中损失部分活性,根据经验需使用基础计算补体用量的倍,即直接配个单位的补体。但习惯上仍称为个单位。其计算见式犡滴定前补体稀释倍数个单位补体用量正式试验时每管补体用量举例如找出个单位补体用量为,代入式犡定各对照的结果如下时,则可以判定被检血清。否则,补体的效价应重新测定,并重新做。个单位补体对照溶血。和个单位补体对照溶血。抗原对照溶血。红细胞对照不溶血。阳性血清对照结果与已知效价符合度个滴度。阴性血清对照溶血。血清抗补体对照如果抗补体管与试验管的抑制溶血程度相同说明该血清。

9、反应抑制剂样品已降解或样品没有加入到反应体系中。应稀释样品来降低反应抑制剂的浓度或用布氏杆菌检疫技术规范.内读值。犕判定当空白对照和孔平均值应小于校正后的参考血清和孔平均值应大于或等于校正后的参考血清和孔的阳性百分率小于校正后的参考血清和的阳性百分率大于时,方可进行被检样品的结果判定。血清值校正公式见式犃犅犆式中犃参考血清或被检样品的校正值犅参考血清或被检样品的值犆空白对照的值。阳性百分率计算见式狆狆犃犇式中狆狆阳性百分率,犃参考血清或被检样品的校正值犇参考血清的校正值。乳液样品的阳性百分率小于时为阴性,大于或等于时为阳性。犛犖犜附录犖资料性附录竞争酶联免疫吸附试验犖原理用流产型布氏杆菌抗原包被板,加入血清样品,然后加入单克隆。

10、考血清阳性对照血清参考血清阴性对照血清参考血清弱阳性对照血清倍浓缩的稀释液底物倍浓缩的洗液终止液。聚合酶链反应犘犆犚试剂和材料细菌基因组提取试剂盒。犛犖犜布氏杆菌质控菌株菌株目录号为牛布氏杆菌大肠杆菌质控菌株菌株目录号为。犜犪狇聚合酶相对分子质量标准用本标准方法和指定单位生产的布氏杆菌凝集抗原测定国际标准血清时,其效价正好为,因此本标准方法测定的被检血清的效价的倒数即为其国际单位数。例如本标准方法测定的被检血清最终效价为,则用国际凝集单位表示为。犛犖犜附录犈资料性附录溶血素效价的测定表犈溶血素测定结果溶血素稀释度补体用量稀释∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶注表示溶血表示不溶血。犛犖犜附录犉资料性附录补体效价的计算基础计算见式用于。

11、为抗补体。通常,被检血清稀释∶达到抑制溶血时判为阳性。在进出口检疫中对阴性阳性判定标准有规定的按规定执行结果判定。需要采用国际补体结合单位表示试验结果时,可参照附录中的换算公式换算成国际补体结合单位。微量法试剂和材料试验用蒸馏水为中的级水。稀释液生理盐水。补体结合抗原按说明书使用,使用前充分摇匀。阳性对照血清阴性对照血清溶血素补体,均为冻干品,使用前用蒸馏水溶解至规定容积。绵羊全血选健康成年绵羊,无菌颈脉采血,阿氏液中加血,混匀,冰箱内保存后备用。玻璃试管,圆底,洁净。孔。犖取被检血清分别加入到试验板相应孔中,确诊试验时建议作双孔。犖依据试验所需量取若干个冻干的单克隆抗体试剂瓶,向瓶中加入样品稀释液,轻轻混匀,不要用蜗旋振荡器混。

12、溶血,被体对照为溶血,红细胞对照为不溶血,血清对照为溶血时,试验成立。犛犖犜附录犔规范性附录标准溶血孔的配制犔制备血红素犔取绵羊红细胞,加入到蒸馏水中,充分破解。犔加入氯化钠,即可。犔制备绵羊红细胞取绵羊红细胞,加入到稀释液中。犔标准血清和孔平均值大于阳性对照血清值与阴性对照血清值犛犖犜孔的比大于等于时,方可进行被检样品的结果判定。犛犘百分率计算见式犛犘犃犅犆犅式中犛犘犛犘百分率,犃被检血清样品的值犅阴性对照血清的值犆阳性对照血清的平均值。被检血清样品的犛犘百分率小于等于时判为阴性,大于或等于时判为阳性,介于与之间时判为可疑,可疑样品应重复试验进行确认。犕示例适用于乳液样品检测犕试剂盒组成包被抗原的孔微量反应板倍浓缩的酶结合物参。

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