1、箱中保温。保温期间振摇数次,活化系统标准诱变剂操作步骤等。代谢活化系统制备所用酶的诱导剂选用的动物品种和来源混合液的配方。如是通过购买获得应注明生产单位和批号。对照物阳性对照物的名称生产厂家批号和选用浓度。溶液用甲基亚砜配制适当浓度的储备液,避光冷藏保存。的终浓度通常为,实验室应根据各种细胞系选择的适当终浓度,以达到理想的双核细胞出现频率。氯化钾溶液氯化钾加蒸馏水至。每个剂量组至少分析个细胞,计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于,则应采用多次细胞培养或平行培养。数据处理和结果评价数据处理数据按不同剂量列表,指标包括细胞毒性观察细胞数含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与阴性对照组溶媒对照组阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法如χ检验进行处理。结果判定下列。

2、验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物对体外哺乳类细胞的染色体损伤作用。检验对象包括食品及其原料食品添加剂新食品原料辐照食品食品相关产品用于食品的包装材料容器洗涤剂消毒剂和用于食品生产经营的工具设备以及食品污染物。术语和定义微核染色单体或染色体的无着丝粒断片,或因纺锤体受损而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期,仍然遗留在细胞质中。末期之后,单独形成个或几个规则的次核,被包含在子细胞的胞质内含微核细胞。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于,则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞如两个核大小相差悬殊和多于两个核的细胞不进行分析。方案不使用每个剂量组至少分析个细胞,计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于,则应采用多次细胞培养或平行培养。数据处理和结。

3、缓冲液。试验方法受试物固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中,并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配,否则须确认储存不影响其稳定性。细胞可选用中国仓鼠肺细胞株或卵巢细胞株小鼠淋巴瘤细胞株人外周血淋巴细胞株如和原代培养细胞。推荐使用或细胞株。细胞在有丝分裂原如刺激后开始受试物处理,这时细胞开始进入分裂周期。如果短期处理的试验结果为阴性或不明确时,需要进行无的长期处理试验,用和受试物处理细胞个正常细胞周期,在处理结束后收集细胞。如果已知或怀疑受试物如核苷类物质可能影响细胞周期特别是活性细胞,则细胞收获时间应该再延长个正常细胞周期。葡萄糖磷酸钠盐溶液。姬姆萨染液取姬姆萨染料,置乳钵中,加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至,待完全溶解后,再加甘油,放入温。

4、中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器低于,或组织匀浆器低于,中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温高速离心机上以离心,吸出上清液为组分,分装于无菌冷冻管中,每管左右,最好用液氮或干冰速冻后置低温保存。组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量法,每毫升蛋白用时应设空白对照。试验步骤细胞准备将定数量的细胞接种于培养皿瓶中,以收获细胞时,培养皿瓶的细胞未长满为标准,贴壁细胞般以长到左右为佳。受试物处理方案使用吸去培养液,用磷酸盐缓冲液洗细胞,加入无血清培养液及定浓度的受试物需代谢活化者同时加入,置于培养箱中结束后吸去含受试物的培养液,用洗细胞,加入含血清的新鲜培养液和,继续培养个正常细胞周期后收集细胞。对于淋巴细胞,最有效的方法是规定了体外哺乳类细胞微核试。

5、明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒性。般由组分和辅助因子按∶组成的混合液,无菌现用现配。混合液配制如下取上述磷酸盐缓冲液镁钾溶液葡萄糖磷酸钠盐溶液辅酶溶液肝组分,混匀,置冰浴中待用。食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿。如果短期处理试验方案在存在和制选健康雄性成年或大鼠,体重,约周龄周龄。将多氯联苯溶于玉米油中,浓度为,按体重无菌操作次腹腔注射,后处死动物,处死前禁食。也可采用苯巴比妥钠和萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和萘黄酮,剂量均为体重,连续,禁食后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能液取磷酸氢钾溶于去离子水中,配成溶液取第液加于第液中混匀,即为的磷酸盐。

6、两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义,并与因比主核小,故称为微核。着丝粒染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域。非整倍体倍体染色体组中缺少或额外增加条或若干条完整的染色体的变异类型。非整倍体诱变剂作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期,导致细胞分裂异常,诱发非整倍体的物质。染色体断裂染色体臂出现长度大于染色体臂宽度的裂隙。染色体断裂剂引起染色体发生断裂的物质。如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂,可用荧光原位杂交或引物原位标记等方法。阅片微核的判断标食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿.过年。混合液的制备混合液浓度般为,实际使用浓度可由各实验室决定,但需对其活性进行鉴定,必须能明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒。

7、果评价数据处理数据按不同剂量列表,指标包括细胞毒性观察细胞数含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与阴性对照组溶媒对照组阳性对照组的微核过年。混合液的制备混合液浓度般为,实际使用浓度可由各实验室决定,但需对其活性进行鉴定,必须能明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒性。般由组分和辅助因子按∶组成的混合液,无菌现用现配。混合液配制如下取上述磷酸盐缓冲液镁钾溶液葡萄糖磷酸钠盐溶液辅酶溶液肝组分,混匀,置冰浴中待用。食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿。如果短期处理试验方案在存在和溶于玉米油中,浓度为,按体重无菌操作次腹腔注射,后处死动物,处死前禁食。也可采用苯巴比妥钠和萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和萘黄酮,剂量均为体重,连续,禁食后断头处。

8、或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配,否则须确认储存不影响其稳定性。细胞可选用中国仓鼠肺细胞株或卵巢细胞株小鼠淋巴瘤细胞株人外周血淋巴细胞株如和原代培养细胞。推荐使用或细胞株。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。剂量剂量设置至少应设置个检测剂量。受试物没有细胞毒性时,从最高剂量往下设至少个剂量,般情况下间隔系数可为有细胞毒性时,其剂量范含微核细胞。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于,则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞如两个核大小相差悬殊和多于两个核的细胞不进行分析。方案不使用每个剂量组至少分析个细胞,计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于,则应采用多次细胞培养或平行培养。数据处理和结果评价数据处理数据按不同剂量列表,指标包。

9、死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝湿重加氯化钾溶液,连同烧杯移入冰浴中,用消毒食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿.量不超过为宜,并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于低温或冰冻干燥,保存期不超过年。混合液的制备混合液浓度般为,实际使用浓度可由各实验室决定,但需对其活性进行鉴定,必须能明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒性。般由组分和辅助因子按∶组成的混合液,无菌现用现配。混合液配制如下取上述磷酸盐缓冲液镁钾溶液葡萄糖磷酸钠盐溶液辅酶溶液肝组分,混匀,置冰浴中待过年。混合液的制备混合液浓度般为,实际使用浓度可由各实验室决定,但需对其活性进行鉴定,必须能。

10、将制成的肝匀浆在低温高速离心机上以离心,吸出上清液为组分,分装于无菌冷冻管中,每管左右,最好用液氮或干冰速冻后置低温保存。组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量法,每毫升蛋白含量不超过为宜,并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于低温或冰冻干燥,保存期不度。食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿。如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂,可用荧光原位杂交或引物原位标记等方法。阅片微核的判断标准微核般为圆形或椭圆形直径不超过主核的与主核在个焦点平面上,与主核的颜色结构特征及折光性致与主核之间没有核物质相连,可以和主核有边界的重叠,但能看清各自的核膜。方案使用每个剂量组至少分析个双核细胞,计算微核细胞率个双核细胞不论含有几个微核,都只算作适当浓度。液体受试物可直接使用。

11、括细胞毒性观察细胞数含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与阴性对照组溶媒对照组阳性对照组的微核溶液用甲基亚砜配制适当浓度的储备液,避光冷藏保存。的终浓度通常为,实验室应根据各种细胞系选择的适当终浓度,以达到理想的双核细胞出现频率。氯化钾溶液氯化钾加蒸馏水至。固定液甲醇∶冰醋酸为∶,临用前配制。姬姆萨染液取姬姆萨染料,置乳钵中,加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至,待完全溶解后,再加甘油,放入温箱中保温。保温期间振摇数次,制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝湿重加氯化钾溶液,连同烧杯移入冰浴工作方法,保持工作热情做到在攻坚克难调处突出信访问题时,注意凝聚民心。以优秀信访干部潘作良同志为榜样,以建设工作流群众满意的信访部门为载体,以切实维护群众合法权益,及时述职报告市信访局述职报告网友。

12、性。般由组分和辅助因子按∶组成的混合液,无菌现用现配。混合液配制如下取上述磷酸盐缓冲液镁钾溶液葡萄糖磷酸钠盐溶液辅酶溶液肝组分,混匀,置冰浴中待用。食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验征求意见稿。如果短期处理试验方案在存在和胞率用适当的统计学方法如χ检验进行处理。结果判定下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义,并与剂量相关受试物在任何个剂量条件下,引起的微核细胞率增加具有统计学意义,并有可重复性。试验报告试验名称试验单位名称和联系方式报告编号。试验委托单位名称和联系方式样品受理日期。食品安全国家标准体外哺乳类细胞微核试验范围本标准刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器低于,或组织匀浆器低于,中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。。

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