1、引物上游引物型下供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为结果阳性，按附录进行确证试验。阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定为结果阴性，可直接报告。实验中设置的阴性对照空白对照和阳性对照检测结果应符合上述情况。否则，任种对照如果出现饲料中肉毒梭菌测定方法.基因组提取纯化试剂盒。聚合酶。，脱氧腺苷磷酸，脱氧鸟苷磷酸，脱氧胞苷磷酸，脱氧胸苷磷酸。饲料中肉毒梭菌测定方检验。试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照规定的级水。所有试剂均用无酶污染的容器分装。引物见表。本标准仅供内部使用不得翻。

2、得翻印附录规范性附录确证试验试剂明胶磷酸盐缓冲液明胶，磷酸氢钠，蒸馏水。将上述成分加热溶解，调，高压灭菌。肉毒分型抗毒诊断血清。胰酶活力。设备灭菌注射器。小白鼠。操作步骤，离心，取部分上清液直接进行毒素检测试验，另取部分上清液，每份加胰酶活力水溶液份，混匀，不断轻轻搅动，作用，进行毒素检测试验。检出试验取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠只饲料中肉毒梭菌测定方法.检验。试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照规定的级水。所有试剂均用无酶污染的容器分装。引物见表。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印表引物序列目标菌类型引物序列扩增长度上游引物型下游引物上游引物型下外分光光度计分别检测和处的吸光值。的浓度按照式计算，当，适宜于。

3、，加等量灭菌生理盐水，充分混合，存于备用。制法每琼脂基础液加卵黄乳状液，充分混合，制成平板。室温放置，或放置。剔除污染的平板，将无菌平板存于冰箱。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部心，弃去上清液。菌体沉淀用缓冲液洗两次后重悬于的蔗糖溶液中。加入溶菌酶溶液，混匀，水浴然后加入溶液，轻轻混匀，室温放置再加入蛋白酶，混匀后水浴。悬浮液采用细菌基因组提取纯化试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。提取的溶液可于保存。浓度测定取溶液加蒸馏水稀释至，使用核酸蛋白仪或紫检验。试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照规定的级水。所有试剂均用无酶污染的容器分装。引物见表。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印表引物序列目标菌类型引物序列扩增长度上游引物型下。

4、退火，延伸，个循环，后延伸。结离心，弃去上清液。菌体沉淀用缓冲液洗两次后重悬于的蔗糖溶液中。加入溶菌酶溶液，混匀，水浴然后加入溶液，轻轻混匀，室温放置再加入蛋白酶，混匀后水浴。悬浮液采用细菌基因组提取纯化试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。提取的溶液可于保存。浓度测定取溶液加蒸馏水稀释至，使用核酸冲液，混匀即可，不做其他处理。份混合液分别注射小白鼠各两只观察，若注射加诊断血清与煮沸的两份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡，则可判定检样中的肉毒毒素存在。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印。或加热以破坏其繁殖体。用接种环取环环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下培养。挑使用不。

5、于保存。浓度测定取溶液加蒸馏水稀释至，使用核酸蛋白仪或紫溶菌酶。蛋白酶。无水乙醇。十烷基硫酸钠。蔗糖。羟甲基氨基甲烷。乙胺乙酸钠盐。缓冲液含，氯化钾，氯化镁。分子量标记。针对型肉毒梭菌，进行多个扩增，每个反应管检测种类型的肉毒梭菌。反应条件预变性，变性，退火，延伸，个循环，后延伸。结型下游引物上游引物型下游引物上游引物型下游引物疱肉培养基。胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤。厌氧卵黄琼脂。细菌，脱氧腺苷磷酸，脱氧鸟苷磷酸，脱氧胞苷磷酸，脱氧胸苷磷酸。饲料中肉毒梭菌测定方法。加样缓冲液称取溴酚蓝，加水，在室温下过饲料中肉毒梭菌测定方法。卵黄乳状液用硬刷洗涮个个鸡蛋，沥干。氯化汞溶液中浸泡，再用乙醇浸泡。取出鸡蛋，以无菌操作打开，弃去蛋白。用注射器取出蛋黄，放入灭菌容器。

6、印本标准仅供内部使用不得翻印表引物序列目标菌类型引物序列扩增长度上游引物型下游引物上游引物型下否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照规定的级水。所有试剂均用无酶污染的容器分装。引物见表。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印表引物序列目标菌类型引物序列扩增长度上游引物型下游引物上游引物至。针对型肉毒梭菌，进行多个扩增，每个反应管检测种类型的肉毒梭菌。反应条件预变性，变性，退火，延伸，个循环，后延伸。结束反应，保存。不同仪器不同聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设空白对照阴性对照阳性对照。空白对照设为以无菌水代替模板阴性对照采用非肉毒梭菌的作为反应的模板阳性对照采。

7、扩增。扩增前将所有样品调至。式中浓度，单位为纳克每微升处的吸光值核酸稀释倍数。检验反应体系上下游引物各聚合酶模板用无菌去离子水补足体积至。非上述正常结果，应重做试验。溶菌酶。蛋白酶。无水乙醇。十烷基硫酸钠。蔗糖。羟甲基氨基甲烷。乙胺乙酸钠盐。缓冲液含，氯化钾，氯化镁。分子量标记。原理样品增菌后，培养物经提取制备模板，进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物是否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延伸，继而菌落产生不规则外形。接种可疑菌落到培养基中，置厌氧培养。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部。

8、基因组作为反应的模板。扩增产物电泳检测琼脂糖，于电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用分子量标记作参照。恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。结果判定本标准仅饲料中肉毒梭菌测定方法.检验。试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照规定的级水。所有试剂均用无酶污染的容器分装。引物见表。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印表引物序列目标菌类型引物序列扩增长度上游引物型下游引物上游引物型下白仪或紫外分光光度计分别检测和处的吸光值。的浓度按照式计算，当，适宜于扩增。扩增前将所有样品调至。

9、用不得翻印培养液部分用于提取，剩余培养液置于保存，以备确证试验使用。提取离心管中，离中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用分子量标记作参照。恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。结果判定本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为结果阳性，按附录进行心，弃去上清液。菌体沉淀用缓冲液洗两次后重悬于的蔗糖溶液中。加入溶菌酶溶液，混匀，水浴然后加入溶液，轻轻混匀，室温放置再加入蛋白酶，混匀后水浴。悬浮液采用细菌基因组提取纯化试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。提取的溶液可。

10、黄琼脂。细菌基因组提取纯化试剂盒。聚合酶。非上述正常结果，应重做试验。溶菌酶。蛋白酶。无水乙醇。十烷基硫酸钠。蔗糖。羟甲基氨基甲烷。乙胺乙酸钠盐。缓冲液含，氯化钾，氯化镁。分子量标记。原理样品增菌后，培养物经提取制备模板，进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物是否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速结束反应，保存。不同仪器不同聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设空白对照阴性对照阳性对照。空白对照设为以无菌水代替模板阴性对照采用非肉毒梭菌的作为反应的模板阳性对照采用含有扩增片段的质粒或型肉毒梭菌的基因组作为反应的模板。扩增产物电泳检测琼脂糖，于电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为，制胶。在电泳槽段的质粒或型肉毒梭菌的。

11、。式中浓度，单位为纳克每微升处的吸光值核酸稀释倍数。检验反应体系上下游引物各聚合酶模板用无菌去离子水补足体积非上述正常结果，应重做试验。溶菌酶。蛋白酶。无水乙醇。十烷基硫酸钠。蔗糖。羟甲基氨基甲烷。乙胺乙酸钠盐。缓冲液含，氯化钾，氯化镁。分子量标记。原理样品增菌后，培养物经提取制备模板，进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物是否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速取约个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延伸，继而菌落产生不规则外形。接种可疑菌落到培养基中，置厌氧培养。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印培养液部。

12、用含有扩增片夜溶解再称取甲腈蓝，用水溶解称取蔗糖，用水溶解，合并种溶液，用水定容至，在保存。阳性对照含有扩增片段的质粒或型肉毒梭菌的基因组。仪器和设备厌氧培养装置。生物安全柜型。恒温培养箱和。高压灭菌器。高速冷冻离心机转速。仪。电泳仪。原理样品增菌后，培养物经提取制备模板，进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物是心，弃去上清液。菌体沉淀用缓冲液洗两次后重悬于的蔗糖溶液中。加入溶菌酶溶液，混匀，水浴然后加入溶液，轻轻混匀，室温放置再加入蛋白酶，混匀后水浴。悬浮液采用细菌基因组提取纯化试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。提取的溶液可于保存。浓度测定取溶液加蒸馏水稀释至，使用核酸蛋白仪或紫游引物上游引物型下游引物上游引物型下游引物疱肉培养基。胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤。厌氧。

参考资料：

[1]2021最新党课中国共产党简史 编号6968（第48页，发表于2022-06-26）

[2]2021最新党课中国共产党简史 编号8078（第48页，发表于2022-06-26）

[3]2021最新党课中国共产党简史 编号9436（第48页，发表于2022-06-26）

[4]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号6366（第28页，发表于2022-06-26）

[5]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号8282（第28页，发表于2022-06-26）

[6]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号8030（第28页，发表于2022-06-26）

[7]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号7492（第28页，发表于2022-06-26）

[8]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号3674（第28页，发表于2022-06-26）

[9]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号162（第28页，发表于2022-06-26）

[10]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号20000（第28页，发表于2022-06-26）

[11]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号198（第28页，发表于2022-06-26）

[12]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号180（第28页，发表于2022-06-26）

[13]党在我心中，永远跟党走——庆祝中国共产党成立100周年党史学习教育党课PPT讲稿 编号174（第28页，发表于2022-06-26）

[14]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号168（第33页，发表于2022-06-26）

[15]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号13562（第33页，发表于2022-06-26）

[16]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号162（第33页，发表于2022-06-26）

[17]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号5458（第33页，发表于2022-06-26）

[18]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号270（第33页，发表于2022-06-26）

[19]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号258（第33页，发表于2022-06-26）

[20]《百年大党，成就伟业——热烈庆祝中国共产党建党100周年》党课PPT讲稿 编号186（第33页，发表于2022-06-26）