1、，发挥重要的结构性支撑作用，在精子运动中调节其柔韧度鞭毛摆动方向及幅度。第，在为精子鞭毛运动提供能量抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。的体外合成利用试剂盒，在体外通过聚合酶完成。的合成利用试剂盒，在体外通过聚合酶完成。上述载体转录合成均在南京大学模式动物研究所完成。检测蛋白在睾丸精子内的表达取种基因型雄鼠，将附睾及睾丸组织用蛋白裂解液提取蛋白作检测。电泳电压为恒压约，待溴酚蓝进入分离胶层，将电压调节至恒压至电泳结束。常规在预冷转移缓冲液中进行转膜，组电压恒压，组电压恒压。膜以封闭后，抗孵育过夜抗抗体∶稀释，抗抗体∶稀释。洗膜次，常温孵育抗山羊抗豚鼠曾被认为是在精子穿过透明带过程所必需的。

2、基因型鉴定代小鼠分子质量标准野生型对照鼠阴性对照应用鉴定引物进行扩增后电泳结果阳性鼠扩增片段大小为野生型无条带应用鉴定引物进行扩增后电泳结果非纯合小鼠扩增产物大小为纯合突变小鼠此产物消失提示和为阳性小鼠以杂合小鼠与杂合小鼠交叉繁育获得双杂合雄鼠，以双杂合雄鼠与背景鼠经体外受精获得同代型小鼠后，以雌雄互配，以雄鼠配雌鼠，以雄鼠配雌鼠，雌雄互配，从而最终获得双基因敲除纯合子小鼠，并进行基因型鉴定，同时获得鼠双基因靶向敲除动物模型的建立和鉴定实验医学证实并非如此。如蛋白酶精子顶体酶曾被认为是在精子穿过透明带过程所必需的，后通过基因敲除小鼠研究证实缺乏这些蛋白的精子同样可以穿过透明带。可见在精子发生和形成过程中，。

3、的研究证实其不同异构体可形成聚体和寡聚体参与纤维鞘的装配，通过免疫共沉淀和酵母双杂交技术还证实，蛋白和纤维鞘骨架蛋白及信号通路蛋白均具免疫荧光检测蛋白在双基因敲除小鼠精子上的表达取种基因型雄鼠精子样本，经相应抗体免疫荧光染色后，臵于荧光显微镜下选取视野拍照，结果显示除头部着色外，尾部主段同时有绿色和红色荧光呈黄色，表明其主段同时有蛋白表达。尾部主段出现的绿色荧光，无的红色荧光小鼠精子仅头部着蓝色荧光，尾部未出现蛋白荧光图。图代小鼠基因测序结果图蛋白在双基因敲除纯合子小鼠及杂合子中表达的分析讨论精子纤维鞘是精子鞭毛主段所独有的，环绕于外致密纤维和轴丝之外的细胞骨架结构。基于现有研究，纤维鞘至少存在方面作用第。

4、时有序表达引导各细胞结构的有序形成，包括精子鞭毛的骨架结构形成并与对应蛋白的精确有序装配等，保证精子结构及功能的形成。钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白以及纤维鞘结合蛋白均在精子形成过程中特异性表达并定位于精子鞭毛纤维鞘上，而且该两种蛋白均具有钙结合能力，在精子获能过程中均可发生磷酸化作用，提示该两种蛋白极有可能参与了精子运动功能的调节，。同时，本课题组前期研究发现蛋白可形成巨分子蛋白复合物，装配于纤维鞘的骨架蛋白上，共同参与发挥纤维鞘的生理功能但单基因敲除小鼠并没有显示明显的精子表型改变。因此，为探讨蛋白复合物在纤维鞘中的生理作用及参与精扩增产物大小为纯合突变小鼠此产物消失提示和可能为阳性小鼠图基因敲除后代小鼠。

5、纤维鞘中的生理作用，以及该两种蛋白缺失样基因双突变小鼠既表现出纤维鞘结构和形态的异常主段变薄和碎裂，伴随着水平的降低，同时也出现精子活力和依赖性信号传导过程的缺陷，从而导致男性不育。本研究组长期致力于纤维鞘相关蛋白和的功能研究并已经获得多方面认识。是种纤维鞘上既具有钙结合能力，又在获能过程中进行磷酸化调节的多态性精子运动和获能相关蛋白。该蛋白在精子形成后期表达并逐渐迁移至精子纤维鞘上，在获能过程中不但发生由介导的丝氨酸苏氨酸磷酸化，而且发生由酪氨酸激酶介导的酪氨酸磷酸化，尤其是其磷酸化的同时还表现出钙结合能力的显著提高，显示该蛋白依赖于获能过程的磷酸化作用在钙信号传导中具有重要调节作用。本研究组前期对蛋白。

6、，后通过基因敲除小鼠研究证实缺乏这些蛋白的精子同样可以穿过透明带。可见在精子发生和形成过程中，可能许多生理功能的完善存在些代偿机制。为深入探讨与结合的复合物在精子中的生物学功能，本研究在前期已经获得单基因敲除小鼠模型的基础上，进步采用系统及受精卵注射的方式成功建立两个能稳定遗传的基因敲除小鼠模型品系，进而与前期建立的敲除小鼠模型进行交叉繁育，最终获得双基因敲除小鼠，为探讨蛋白及蛋白缺失后对小鼠精子的形态结构及功能的影响奠定了基础。基于前期对蛋白蛋白相关功能的研究，预期其复合物作为精子尾部纤维鞘的必要组成部分，在调节精子尾部韧性及活动能力等方面发挥重要作用，并且可能通过对精子信号通路中通道蛋白的调控而发挥功。

7、可能许多生理功能的完善存在些代偿机制。为深入探讨与结合的复合物在精子中的生物学功能，本研究在前期已经获得单基因敲除小鼠模型的基础上，进步采用系统及受精卵注射的方式成功建立两个能稳定遗传的基因敲除小鼠模型品系，进而与前期建立的敲除小鼠模型进行交叉繁育，最终获得双基因敲除小鼠，为探讨蛋白及蛋白缺失后对小鼠精子的形态结构及功能的影响奠定了基础。基于前期对蛋白蛋白相关功能的研究，预期其复合物作为精子尾部纤维鞘的必要组成部分，在调节精子尾部韧性及活动能力等方面发挥重要作用，并且可能通过对精子信号通路中通道蛋白的调控而发挥功能化调控建了基因敲除小鼠，并进行了相关表型观察，结果显示雄鼠精子密度活率和各项运动参数与野生型。

8、钙结合能力的显著提高，显示该蛋白依赖于获能过程的磷酸化作用在钙信号传导中具有重要调节作用。本研究组前期对蛋白的研究证实其不同异构体可形成聚体和寡聚体参与纤维鞘的装配，通过免疫共沉淀和酵母双杂交技术还证实，蛋白和纤维鞘骨架蛋白及信号通路蛋白均具有明确的紧密相互作用，可能形成鼠双基因靶向敲除动物模型的建立和鉴定实验医学∶稀释，山羊抗兔∶稀释。洗膜次，曝光。免疫荧光观察蛋白在基因敲除小鼠精子上的表达按前述方法取小鼠附睾精子，臵于中获能后，取涂于载玻片上，充分干燥后，多聚甲醛固定，再于室温干燥后，使用或储存于冰箱备用取精子涂片室温下复温，清洗次加快速抗原修复液孵育，清洗次取含的孵育，再用清洗次加免疫染色封闭液孵育。

9、均无明显差异。与野生型相比，杂合子和纯合子雄鼠精子与透明带完整卵细胞及无透明带卵细胞的结合和融合的能力均无差异。体内实验显示野生型杂合子和纯合子雄鼠使雌鼠的受孕率和每胎雌鼠产仔数均无差异，表明敲除基因对雄性小鼠精子的运动功能及体内外受精能力均无明显影响，提示蛋白的独立缺失并不影响精子的功能，对于精子的运动和授精能力的维持，该蛋白并非不可或缺。而近来针对的研究显示，基因敲除后雄性小鼠表现出严重的生育能力低下，精子运动能力缺陷，双联微管的结构异常，纤维鞘明显紊乱，这表明纤维鞘对于轴丝的正确组装具有重要作用。而且，在纤维鞘的形成过程中，是雄性生殖所必需的蛋白。基于本研究的前期发现，为进步深入探讨和蛋白复合物在精。

10、的形成过程中，是雄性生殖所必需的蛋白。基于本研究的前期发现，为进步深入探讨和蛋白复合物在精子纤维鞘中的生理作用，以及该两种蛋白缺失可能对精子相关结构和功能造成的影既表现出纤维鞘结构和形态的异常主段变薄和碎裂，伴随着水平的降低，同时也出现精子活力和依赖性信号传导过程的缺陷，从而导致男性不育。本研究组长期致力于纤维鞘相关蛋白和的功能研究并已经获得多方面认识。是种纤维鞘上既具有钙结合能力，又在获能过程中进行磷酸化调节的多态性精子运动和获能相关蛋白。该蛋白在精子形成后期表达并逐渐迁移至精子纤维鞘上，在获能过程中不但发生由介导的丝氨酸苏氨酸磷酸化，而且发生由酪氨酸激酶介导的酪氨酸磷酸化，尤其是其磷酸化的同时还表现出。

11、，弃封闭液，勿洗加稀释后抗抗∶，抗∶，孵育过夜，用含的清洗次加∶稀释后相应抗，孵育，弃抗，用含的清洗次取室温避光染核，孵育，用含的清洗次抗荧光猝灭封片剂封片后立即臵于荧光显微镜下观察，拍照。鼠双基因靶向敲除动物模型的建立和鉴定实验医学鼠基因鉴定及测序代初建鼠在出生时，剪取鼠尾组织提取基因组。设计对包含作用靶点的鉴定引物，引物引物，。反应体系。反应条件，每循环降，循环循环保存于。产物用的琼脂糖凝胶电泳分离，通过产物进行判断可能的阳性鼠及鉴定纯合性。引物用以检测靶基因相应位点产生了突变的阳性鼠，扩增片段大小为，野生型无该条带引物用以检测纯合性，非纯合小鼠扩增产物大小为，纯合突变小鼠此产物消失。和表达载体的体外。

12、化调控作用。本研究后期将利用了相关表型观察，结果显示雄鼠精子密度活率和各项运动参数与野生型均无明显差异。与野生型相比，杂合子和纯合子雄鼠精子与透明带完整卵细胞及无透明带卵细胞的结合和融合的能力均无差异。体内实验显示野生型杂合子和纯合子雄鼠使雌鼠的受孕率和每胎雌鼠产仔数均无差异，表明敲除基因对雄性小鼠精子的运动功能及体内外受精能力均无明显影响，提示蛋白的独立缺失并不影响精子的功能，对于精子的运动和授精能力的维持，该蛋白并非不可或缺。而近来针对的研究显示，基因敲除后雄性小鼠表现出严重的生育能力低下，精子运动能力缺陷，双联微管的结构异常，纤维鞘明显紊乱，这表明纤维鞘对于轴丝的正确组装具有重要作用。而且，在纤维鞘。

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