毕业论文：非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究

本研究的目的就是将该新型疫苗免疫育肥猪，通过间接法检测抗生长抑素抗体，探讨其免疫效果。

材料与方法材料质粒和菌株缺失基因的减毒猪霍乱沙门氏菌和质粒均由实试验室保存。

质粒的构建图如下实验试剂溶菌液为的磷酸盐缓冲液，培养基为胰化蛋白胨酵母提取物和氯化钠组成的液体培养基，二氨基庚二酸过滤除菌，包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，封闭液为的脱脂牛奶溶液，稀释液为的磷酸盐缓冲液，兔抗猪，洗涤液为吐温水溶液，显色液，硫酸终止液。

实验仪器恒温水浴摇床酶标仪恒温培养箱冷冻离心机微量加样器。

实验动物日龄育肥猪，选自武汉附近商品化猪场。

华中农业大学本科毕业论文疫苗准备和免疫方法疫苗准备挑取和单菌落分别接种于液体培养基振摇培养至为，离心，弃上清，用灭菌的调整细菌浓度至，备用。

免疫方法选日龄育肥猪只，均分为组，每组只。

第组灌注菌液，浓度为，第组灌注菌液，浓度为，第组灌注菌液，浓度为，第组灌注菌液，浓度为，第组灌注空菌组，第组为空白对照组，灌注灭菌溶液。

分别于免疫前和禁食禁水，并在免疫前，预先灌注只的以中和胃酸，然后进行免疫，剂量为只。

初次免疫周后以相同剂量相同方法加强免疫次，再次免疫周后以相同剂量相同方法再加强免疫次。

血样制备每次免疫周后对育肥猪进行颈静脉采血，血液收集后，室温静置，冰箱过夜，然后离心，分离血清，分装后置于冰箱备用。

抗生长抑素抗体检测包被生长抑素抗原每孔，过夜，弃反应液，用液洗次加封闭液孔，反应，弃反应液，用洗涤次的浓度梯度用封闭液稀释加待测血清孔，同时设对照孔调零孔不加任何反应液非特异性吸附孔用缓冲液代替血清，反应，弃反应液，洗涤次加兔抗猪稀释，每孔，反应，弃反应液，洗涤次加底物液，每孔，反应加硫酸终止反应，每孔读数。

结果与分析华中农业大学本科毕业论文非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较通过间接法对各个试验组和对照组的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。

由图可以看出初免后周，试验组的抗体效价水平明显高于对照组，第二次免疫后，试验组的抗体效价水平下降，水平在对照组与对照组之间。

第三次免疫后，试验组的抗体效价水平继续下降，最终下降到与对照组几乎同水平。

图试验组与对照组抗抗体水平检测说明为试验组分别免疫不同浓度的生长抑素基因融合真核表达质粒组为对照组，分别免疫空菌与，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。

不同剂量的质粒免疫各组育肥猪抗体水平通过间接法对不同免疫剂量的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。

图显示初次免疫周后，组抗体效价最高，第二次加强免疫之后，和组的抗体效价有所提高，效价水平在，组之上。

在初次免疫周至五周的这段时间里组的抗体效价表现出较明显的上升趋势，和组的抗体效价表现出下降的趋势，特别是组。

第三次免疫后，组抗体效价均呈现下降趋势，初免后第九周组效价水平最低，组效价水平高于组。

华中农业大学本科毕业论文图不同剂量试验组抗抗体水平检测说明为实验组分别免疫不同浓度的生长抑素基因融合真核表达质粒，浓度依次为，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。

讨论非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。

从试验结果图可以看出，非抗性筛选生长抑素作为种重组型的基因疫苗能够有效的刺激生长育肥猪产生抗生长抑素的抗体。

从而在理论与实际上验证了生长抑素的促生长工作原理从试验分析图中得出所有试验组的抗体水平在生长初期即日龄日龄期间能够有效的刺激机体产生抗体且高于试验对照组的平均水平，而在日龄日龄即出栏前期，生长抑素抗体效价出现回落，且低于试验对照组真核表达质粒，浓度依次为，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。

讨论非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。

从试验结果图可以看出，非抗性筛选生长抑素作为种重组型的基因疫苗能够有效的刺激生长育肥猪产生抗生长抑素的抗体。

从而在理论与实际上验证了生长抑素的促生长工作原理从试验分析图中得出所有试验组的抗体水平在生长初期即日龄日龄期间能够有效的刺激机体产生抗体且高于试验对照组的平均水平，而在日龄日龄即出栏前期，生长抑素抗体效价出现回落，且低于试验对照组的平均水平。

原因可能有以下主要两点，育肥猪在生长后期可能自身生长激素增加，因此相对于外源性基因免疫而引起的反应应答不明显。

，免疫剂量不够。

我们的育肥猪免疫试验是在大量的实验室模式动物小白鼠的基础之上而进行的扩大性生产试验，舒邓群等利用与的融合表达质粒在大鼠与小鼠的动物试验基础上已经确定了是比较合适的免疫剂量。

而未有试验提及育肥猪生长试验，加之本身华中农业大学本科毕业论文研究生长抑素基因疫苗的研究较少。

而未有文献提及适合的免疫剂量，因此此次试验也是为以后的扩大性生产试验摸索条件。

免疫剂量对免疫效果的影响国外学者曾以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功地表达了基因绿色荧光蛋白基因Ⅰ基因李斯特菌溶血素基因等，结果证实利用减毒沙门氏菌作为载体传递疫苗具有良好的免疫原性。

本文正是以减毒的猪霍乱沙门氏菌为载体传递生长抑素基因，并取得了较理想的免疫效果。

基因免疫的剂量取决于疫苗的转染效率和抗原提呈的效率，而它们又受多方面因素的影响。

本研究表明剂量的不同在定程度上增加了抗体水平，在前期即日龄日龄期间组抗体效价最高，而在后期降至低点。

，组在后期免疫应答水平达到较高。

因此不能简单的定论高剂量或者低剂量为育肥猪的合适免疫剂量。

具体免疫条件与免疫周期还需要进步的摸索。

小结本研究表明用基因疫苗免疫育肥猪在免疫初期可以检测到高水平的抗生长抑素抗体。

进步推测出此疫苗免疫大动物可以很好地促进动物的生长，在动物促生长方面具有相当大的应用前景，但是基因疫苗的安全性以及最适免疫剂量还有待进步的研究。

参考文献，华中农业大学本科毕业论文，，徐文忠，杜念兴，李光地等生长抑素与乙肝表面抗原融合基因重组痘苗病毒的构建及其表达南京农业大学学报徐文忠，杜念兴，李光地，汪垣，李载平促进动物生长的新型基因工程疫苗研究中国科学辑，曹少先，张文伟，茆达干，管峰，杨利国生长抑素基因疫苗质粒的构建表达及免疫农业生物技术学报，黄维染色体质粒平衡致死系统的构建和应用生物技术通讯华中农业大学本科毕业论文徐引弟，郭爱珍，刘维红，贾爱卿，陈焕春绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌株缺失株平衡致死载体系统中的表达中国兽医学报，杨利国，胡少昶，魏平华，郭爱珍酶免疫测定技术南京南京大学出版社舒邓群，茆达干，吴志敏，程宝，杨利国以减毒沙门氏菌为载体的与生长抑素融合表达质粒对小鼠淋巴细胞增殖和及Ⅰ分泌的影响畜牧兽医学报Ⅰ，本科毕业论文题目非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究姓名学号专业动物科学指导教师职称中国武汉目录华中农业大学本科毕业论文摘要关键词前言材料与方法材料质粒和菌株实验试剂实验仪器实验动物疫苗准备和免疫方法疫苗准备免疫方法血样制备抗生长抑素抗体检测结果与分析非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较不同剂量的质粒免疫各组育肥猪抗体水平讨论非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。

免疫剂量对免疫效果的影响小结参考文献致谢摘要华中农业大学本科毕业论文将只日龄育肥猪均分为组，组用非抗性筛选生长抑素基因疫苗免疫，剂量浓度分别是，和组为对照组，分别免疫空菌和。

整个试验共免疫三次，每次免疫间隔周。

抗体检测结果显示试验组在免疫初期抗体水平高于对照组，但是免疫后期差异不明显，不同免疫剂量组之间的抗体水平差异不明显。

总之，用新型生长抑素基因疫苗免疫育肥猪在免疫初期可以检测到高水平的抗生长抑素抗体，推测出此疫苗免疫大动物可以很好地促进动物的生长。

关键词生长抑素减毒沙门氏菌基因疫苗育肥猪前言华中农业大学本科毕业论文生长抑素，是下丘脑释放的肽激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别是对生长及免疫反应具有明显的影响，应用生长抑素主动或被动免疫动物，所产生的抗体与结合，能阻断与受体作用同时在肝脏的作用下，加速循环中的清除，从而促进等多种激素的释放，加快动物的生长。

国外已报道应用抗血清被动免疫或化学合成制成免疫原主动免疫牛绵羊等家畜，可以显著提高增重效果。

国内杜念兴等已完成了在大肠杆菌中表达的基因工程亚单位苗痘苗病毒表达的活载体苗等基因工程苗的制备，其中由痘苗病毒表达的基因工程苗已开发成为激生号激生号等商品化产品。

激生号苗对肉猪肉羊肉牛均有定的增重效应，可使肉猪增重提高，饲料报酬提高，肉羊平均体重提。

然而，以上合成肽及活载体苗都存在免疫持续时间短，生产成本高，基因工程表达产物纯化繁杂等不足，此外痘苗病毒还有可能产生毒力回升，造成极大的安全隐患。

由于生长抑素分子量小，免疫原性弱，生长抑素常规免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组以增强生长抑素的免疫原性。

近来，大量的研究证实乙肝表面抗原区的第与氨基酸密码之间可以插入个氨基酸残基的片段，区的末端也可以嵌合外源基因片段，都不影响多聚体颗粒的形成，并且能将外源抗原决定簇呈现在颗粒外表面。

鉴于此，曹少先构建了双拷贝生长抑素疫苗，免疫后大鼠后，抗体阳性率达到。

但是该表达载体都是以抗性基因作为选择压力的，虽然在体外的分子生物学研究中非常有用，但在人和动植物体内无法实现，而且含抗药基因的质粒是导致临床抗药菌株播散的主要原因之同时抗生素的使用是基因工程产品制备过程中造成潜在痕量过敏现象发生的重要来源。

染色体质粒平衡致死系统的出现很好的解决了这个难题，它的宿主菌通常是类染色体突变体，突变的基因是细菌的管家基因，因其编码的产物为细菌生长繁殖所必需，故该基因的缺陷必然导致细菌死亡，该缺陷型菌株表现为不能在基本培养基上生长当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式共同构成染色体质粒平衡致死系统，含有互补质粒的缺陷菌可在基本培养基上生长。

此时，互补质粒对其宿主菌的生长成为必需，旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡，因此，凡是能在基本培养基上生长的缺陷菌株必定含有重组质粒。

华中农业大学本科毕业论文鉴于此，本实验室将平衡致死体系引入生长抑素基因疫苗，构建了非抗性筛选的生长抑素真核表达质粒，并转化至缺失基因的减毒猪霍乱沙门氏菌中。

本研究的目的就是将该新型疫苗免疫育肥猪，通过间接法检测