1、，冰浴的水浴热激，然后立即冰置冷却在超净台中向管中加培养液，在恒温摇床上培养，使细菌恢复正常生长状态，并表达抗性基因常温离心后弃去上清，余下重悬后取均匀涂布于含的固体培养基平皿上，边涂边旋转，置于培养箱中正面朝上，后反置培养过夜，约。小量抽提质粒碱裂解法在无菌条件下挑取上述转化的单克隆至含有液体培养基的管中，置于摇床，过夜取混匀的菌液于管中，室温下离心，弃上清加预冷的Ⅰ重悬细菌，再沿壁缓缓加Ⅱ至管中，轻轻颠倒次，开盖可见抽丝。迅速加预冷的Ⅲ，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状析出物，冰置离心。上清取至新的管中，加酚氯仿等体积至管中，颠倒混匀成。

2、集细胞离心后弃去上清。再次用清洗次，离心，弃上清。用固定液悬浮起细胞，轻轻充分混匀后，于固定。中间需多次轻摇，防止细胞成团沉积。离心后弃上清，加清洗次，再次离心后弃上清。取打孔液悬浮起细胞，在离心管外层裹上锡箔纸避光，用移液枪向离心管内加入染料，吹匀后置于恒温箱中，避光显色。向上述离心管中加入，用尼龙膜过滤后上机检测，相关软件分析结果。人宫颈癌细胞总提取万方数据三峡大学硕士学位论文裂解细胞当细胞生长覆盖时弃去培养基，用预冷的洗两遍。向细胞瓶中加入试剂，溶解细胞，收集至管中。收集物可放置于保存备用，也可继续进行下述操作。去除和蛋白质静置。

3、接种到含有培养基的离心管中，将管盖稍拧松，摇床培养过夜，大约过夜培养的菌液转接到培养基中，摇床，振荡培养约至对数生长期，期间动态检测值，般左右取出溶液浓度置于冰上预冷超净台中，取出两个已高压灭菌的离心管，将摇好的菌液移至离心管中，两管液体量相等，冰上放置冷却。，弃上清加冷却的溶液，轻轻吹打使细胞再次悬浮，冰置。重复此步骤弃去上清，加预冷溶液重悬沉淀。随后加入高压灭菌过的甘油，充分混匀后，将上述悬浮液分装至管中，管，置于保存备用。连接产物转化入从冰箱取出管感受态细胞放冰上解冻，取连接产物小心加万方数据三峡大学硕士学位论文入感受态，轻轻混。

4、在转膜板的黑面，从玻璃板中取出凝胶，切去浓缩胶，放在新的滤纸上，再剪适当大小的膜，用甲醛浸泡后轻轻放在浓缩胶上，上层再用浸泡过的滤纸覆盖，去除气泡后夹紧夹板按黑面到红面或负极到正极顺序依次叠放张滤纸胶膜张张滤纸。置夹板于电泳槽内，加入，电转。转膜后，在膜左上角剪切口做指示。封闭用牛奶室温摇床封闭。抗体孵育封闭过的膜用清洗次，弃去，加入单抗于或鼠单抗于孵育过夜大约。第二日用洗次，次。加入羊抗鼠二抗于室温结合，再次洗次，次。显影在暗室内用显影，胶片曝光。处理细胞后检测细胞周期用处理宫颈癌细胞后，预冷的清洗瓶内的细胞，负压泵吸去上清。消化收。

5、件预变性，个循环。凝胶电泳检测产物片段，预期大小为。表达质粒的构建与鉴定限制性内切酶Ⅰ和分别酶切和产物表酶切反应体系试剂含量质粒或产物核酸内切酶万方数据三峡大学硕士学位论文反应条件，水浴。凝胶电泳检测酶切产物大小。按照说明书，纯化酶切产物连接纯化的酶切产物纯化后的产物分别用琼脂糖凝胶电泳检测大致浓度，根据结果确定连接反应体系如下表连接反应体系试剂含量目的片段载体反应条件，。制备感受态细胞本实验均在超净台中操作，超净台用前紫外光照射，感受态制备过程动作应快速，避免污染。从冰箱取出菌种，冰上解冻，划线后培养箱倒置培养过夜次日挑取单菌落，轻。

6、浑浊白色，冰置。待分层后离心离心后可见层，取最上层液体至干净无菌管中，加无水乙醇于上述管中，颠倒混匀，冰置离心，弃上清，加乙醇，手指轻弹起管底物沉淀，冰置。离心，负压泵吸去上清，再瞬离后用移液枪尽量吸去剩余液体，后置通风橱待乙醇充分挥发。加至管中，溶解后加，混匀后于水浴。置于冰箱保存。重组质粒的鉴定双酶切鉴定重组质粒表双酶切鉴定反应体系试剂含量重组质粒核酸内切酶万方数据分类号密级公开硕士学位论文人宫颈癌细胞中与相关性研究学位申请人吴丽婷学科专业妇产科学指导教师黄利鸣教授王艳林教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学。

7、加氯仿，颠倒混匀，剧烈震荡离心管，冰置离心后取上清，转移到新的管中，注意不要取到下层液体。沉淀上清移至另个管，加异丙醇，混匀离心，弃上清。加乙醇后颠倒混匀，离心分钟，重复本步操作次。收集离心后弃上清，再次给予短暂离心后，用移液枪吸去残液，超净工作台中干燥。加水溶解沉淀，可于保存。浓度和纯度检测取样品与水混合，紫外分光光度法检测，记录数值。凝胶电泳检测纯度及完整性配制琼脂糖凝胶以及新鲜的电泳液。样品共。小心将制好的样品加入上样孔中。，电泳后凝胶成像仪成像后分析。人基因的扩增引物设计为提高扩增片段的特异性，基于中基因序列，我们设计了两对引。

8、式细胞术检测细胞周期的改变细胞划痕试验检测高表达对细胞迁移能力的影响，检测的表达构建质粒并瞬转细胞，然后用上述方法测定高表达对细胞增殖细胞周期，细胞迁移和表达的影响。结果与未做任何处理的细胞相比，处理后细胞表现出典型的间质细胞样形态细胞梭形或细长形，细胞与细胞之间连接松散。结果提示下调的表达，上调的表达。结果显示能促进细胞生长，处理后更多的细胞出现在期细胞，和期细胞而其细胞明显减少细胞，。诱导的过程伴随表达量明显增加，且呈剂量和时间依赖性。稳定克隆细胞比细胞表现出更高的增殖潜能，而与细胞增殖率之间无明显差异。高表达使处于期和期的细胞明。

9、进行巢式，同时便于基因操作，在内侧上游引物和下游引物的末端分别引入Ⅰ和限制性酶切位点。引物设计如下外侧上游引物，下游引物内侧上游引物，下游引物。反转录以试剂法从细胞提取的总为模板，用反转录引物和逆转录酶将其逆转录为第链。表反转录体系试剂含量总水至万方数据三峡大学硕士学位论文前三项加样后变性随后冰浴，加入余下试剂，再放入仪中，延伸，温浴终止反应。其产物即为第链混合物，保存。巢式首先，以为模板，外侧引物扩增得到次产物，琼脂糖凝胶电泳后将目的片段切胶回收，以此为模板，内侧引物扩增得到第二次产物。表反应体系试剂含量上下游引物酶缓冲剂氯化镁反应。

10、据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的本研究以宫颈癌细胞为研究对象，分析在诱导的过程中发挥的作用及其机制，以及对上述功能的影响，以进步评估和作为宫颈癌早期侵袭转移指标的潜在价值。方法处理人宫颈癌细胞，检测其对细胞形态增殖和侵袭转移的影响，及表达量的改变构建重组质粒，并且筛选稳定高表达细胞株法观察克隆细胞生长状况，。

11、升高，而处于期的细胞明显下降，提示上调促进细胞生长。高表达显著性下调表达水平，而高表达能逆转对表达的抑制性影响。这些结果表明，促进进程，而作用相反。细胞的侵袭和转移能力明显高于和细胞。而细胞和细胞的侵袭转移能力之间无明显差别。高表达能逆转对细胞转移能力的影响。这些结果显示抑制诱导的细胞转移。结论体外能诱导细胞发生，并表现出更高的增殖潜能。诱导过程伴随着的高表达。稳定高表达明显促进细胞增殖侵袭和转移。诱发细胞的恶性特征可被部分逆转。上述结果提示，和有作为宫颈癌早期侵袭转移指标的潜在价值。关键词宫颈癌细胞增殖转移万方数据三峡大学硕士学位论。

12、位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验。

参考资料：

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[2]卡通风幼儿园户外活动的组织与实施通用PPT 编号18060（第31页，发表于2022-06-24）

[3]卡通风幼儿园户外活动的组织与实施通用PPT 编号18060（第31页，发表于2022-06-24）

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[19]寝室文化节优秀寝室展示动态PPT 编号18060（第20页，发表于2022-06-24）

[20]寝室文化节优秀寝室展示动态PPT 编号18060（第20页，发表于2022-06-24）