分布主要以科室为主，占，其次为神经外科和脑外科，共占药物敏感性结果显示我院肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率接近，对呋喃妥因的耐药率已高达，对包括头孢曲松头孢他啶在内的三代头孢菌素类甚至是酶抑制剂复合药物氨苄西林舒巴坦的耐药率也都在以上，仅对四代头孢菌素的头孢吡肟的敏感性较好对喹诺酮来药物和氨基糖苷类药物的总体耐药水平较接近，处于之间仅对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性最好，总体耐药率仅为。体外生物膜形成能力的初步分析发现痰液标本来源的菌株形成生物膜的能力高于其他标本来源。株试验菌株对碳青霉烯类药物亚胺培南美罗培南厄他培南中的种甚至是三种药物表现出不同程度的敏感性下降或者耐药。同时发现在近几年中呈现明显的上升趋势，且主要集中在痰液标本。而总体的生物膜形成能力与第部分试验中各类标本的总体水平无差异，中痰液标本生物膜形成能力与第部分试验获得的痰液标本之间也无差异具有超粘特性的菌株产纤维素的菌株形成生物膜的能力并不比表型试验阴性的菌株强，编码菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并没有降低型别菌株生成生物膜的能力与其他型别相比无明显差异。对试验菌株的值范围为，都表现为敏感，而值的范围为，都表现为耐药。但对细菌的值的大小与细菌形成生物膜的能力并没有相关性，即并不是生物膜的值越高，就越高。含亚抑菌浓度的培养基下培养的生物膜的值比不含培养基培养的生物膜值都有不同幅度的提高，即亚抑菌浓度的对每株菌生物膜的形成能力都表现出不同程度的促进作用。另外，外排泵缺失的试验菌株比外排泵基因完整的试验菌株形成生物膜复上述步骤的操作次再次将于离心，并将转移至个新的离心管中。向中加入，并于下温浴，温州医科大学硕士学位论文分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关机制研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型学术型指导教师二四年三月温州医科大学硕士学位论文论文题目耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关机制研究答辩委员会主席答辩委员会成员论文答辩日期温州医科大学硕士学位论文目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分年年间临床分离肺炎克雷伯菌耐药特性研究和不同标本来源的菌株的体外生物膜形成能力测定材料和方法结果分析与讨论第二部分耐碳氢霉烯肺炎克雷伯菌生物膜形成能力相关特性研究材料和方法结果分析与讨论第三部分生物膜形成和外排泵的相关性研究材料和方法结果分析与讨论全文小结正文参考文献附录致谢综述综述参考文献论文独创性声明冲液三羟甲基氨基甲烷温州医科大学硕士学位论文耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关机制研究中文摘要目的研究近几年我院肺炎克雷伯菌在临床上的分布情况和耐药状况，分析耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌在体外形成生物膜的能力和特点，并探讨其生物膜形成的相关机制，为有效防治耐药菌生物膜相关性感染提供理论依据。方法回顾性调查年年间温州医科大学附属第医院临床分离的肺炎克雷伯菌的临床分布特征，分析其对临床常见药物的耐药状况，初步测定不同来源的菌株体外生物膜形成能力。耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药性检测采用琼脂稀释法检测碳青霉烯类药物亚胺培南美罗培南和厄他培南对菌株具体的最低抑菌浓度结果根据年的标准判读。菌株生物膜测定采用孔板结晶紫染色法测定菌株体外生物膜形成能力。菌株生物膜形成相关表型和基因型检测采用超粘表型试验和刚果红试验分析生物膜形成相关的细菌生长表型采用方法扩增菌株中的毒力基因，包括扩增并测序分析肺炎克雷伯菌的个管家基因，比对数据库获得菌株具体的型别。分析生物膜形成能力与上述各种表型基因型别的相关性。测定多粘菌素对菌株的值和生物膜最低消除浓度，值采用琼脂稀释法检测多粘菌素对菌株的值孔板培养生物膜，用不同浓度的多粘菌素处理预生成的生物膜，从而获得具体的。并比较二者的差异性。外排泵抑制剂对生物膜形成的影响及外排泵基因的检测培养生物膜时在中加入不同浓度梯度的，分析外排泵抑制剂对生物膜形成是否有抑制或者诱导促进的作用的方法检测外排泵基因的分布。温州医科大学硕士学位论文细菌不同状态下外排泵基因温州医科大学硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称美国典型菌种保藏中心碱基对临床实验室标准化研究所耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯敏感型肺炎克雷伯菌焦碳酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸超广谱内酰胺酶厄他培南小时中介亚胺培南肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶鲁利亚培养基生物膜最低消除浓度美罗培南最低抑菌浓度分水解酪蛋白多位点序列分型多粘菌素聚合酶链反应实时荧光定量敏感秒敏感序列类型冰醋酸电泳缓文研究菌株为第部分分析筛选的株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，药敏试验质控菌大肠埃希菌购自卫生部临检中心实验阳性对照为本实验室扩增阳性并测序确认后的保存菌株。抗菌药物亚胺培南厄他培南美罗培南，等抗菌药物标准品购自中国药品生物制品检定所。主要材料和试剂细菌提取试剂盒杭州昊天生物科技有限公司反应原料和大连有限公司引物合成及产物测序委托华大基因普通电泳琼脂糖干粉法国有限公司，琼脂英国有限公司核酸染料温州长风生物科技有限公司刚果红美国公司冰醋酸国药集团化学试剂有限公司。生物膜形成试验相关的试剂同第部分。主要仪器和设备聚合酶链反应仪仪凝胶电泳成像分析仪型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司型离心机，分光光度计美国有限公司全功能微孔板检测酶标仪美国公司径迹蚀刻膜美国公司。主要培养基和溶液的配制生理盐水甘油肉汤羊血琼脂培养基液体培养基的配制同第部分。表主要培养基和试剂的配方及配制方法培养基或试剂成分配方配制方法琼脂琼脂琼脂，蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。电泳缓冲液冰醋酸冰醋酸蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。温州医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶琼脂糖干粉琼脂糖干粉缓冲液琼脂糖干粉和缓冲液混匀后，微波炉高求结果在参考范围以内，若超出参考范围，则本次药敏试验的结果不可信，需重复试验。孔板结晶紫染色法测定体外生物膜形成能力生物膜的培养和测定方法同第部分。生物膜形成相关表型的检测超粘表型检测将保存的株用接种环三区划线接种至哥伦比亚血平板上，置孵箱中培养，用接种环在单个菌落表面轻轻接触并向侧面牵拉，如有粘液丝形成且长度大于，判断为阳性。如图所示。图超粘表型试验阳性纤维素生成表型检测将保存的株用接种环三区划线接种至哥伦比亚血平板，次日取单个菌落接种到刚果红平板上，置孵箱中培养，红色菌落代表产纤维素试验阳性，粉色菌落表示不产纤维素，本试验也被称为刚果红试验。如图所示。温州医科大学硕士学位论文图纤维素生成表型试验生物膜形成相关基因的检测细菌基因组的提取试剂盒的准备第次使用前，在试剂瓶中加入溶菌酶，在试剂瓶中加入无水乙醇，在试剂瓶中加入无水乙醇。菌株培养用接种环取环保存菌株，接种到哥伦比亚血琼脂平皿上，培养然后挑取单个菌落至无菌肉汤培养基中，条件下振摇培养至。收集细菌，将上述培养菌液离心，尽可能弃去上清液。向上述沉淀中加入，充分混匀后于下温浴。左右取出混匀下。加入，随后加入，充分混匀。于环境中水浴，然后移出，对于难裂解的样本可以适当延长水浴时间。水浴后向混合液中加入，并混合均匀离心，将上清液转移到个新的离心管中，加的，并混合均匀。将混合液体转移至中，注意透明粘稠样物质为，需并转移，随后于离心，并弃去接液管中的液体，向中加入的，于离心，并弃去接液管中的液体。向中加入，于离心，并弃去接液管中的液体，重热加热至沸腾，取出摇晃，中低热再次加热至完全溶解，冷却至左右，加入左右的，混匀后缓慢倒入电泳模具中，自然凝固后使用。刚果红平板刚果红，胰蛋白胨，酵母浸出液刚果红胰蛋白胨酵母，蒸馏水定容至刚果红溶解至蒸馏水中，经径迹蚀刻膜过滤达到无菌状态，加入到高压并冷却至的无盐琼脂培养基中混匀，倾注至无菌平皿中，无菌试验检测合格后，保存备用。方法琼脂稀释法检测碳青霉烯类药物对具体的最低抑菌浓度细菌的培养将保存的株和药敏质控菌用接种环接种至哥伦比亚血平板上，置孵箱中培养。抗菌药的配制参照中肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的敏感和耐药的界值及质控菌对该类药物的范围，设定各种药物的最高终浓度和最低终浓度，本实验中各种碳青霉烯类药物的终浓度范围为。根据以下公式计算每种药物的质量质量稀释剂用量原液浓度分析效能，以文件推荐的溶解溶剂和稀释溶剂分别进行溶解和倍比稀释。含药琼脂平板的制备用离心管量取已经高压并冷却至的琼脂，从低浓度到高浓度的顺序将倍比稀释的药物加入到琼脂中，混匀后倾注到无菌的塑料平皿中，整个