1、引物的末端，分别引入酶切位点和引物序列中下划线的部分以便随后的克隆操作。引物用软件分析后送上海生工合成。合成后的引物首先经，离心，然后加入超纯水配制成储备液，保存于备用。小鼠肾组织总的抽提采用细胞裂解液抽提参考试剂说明书。取保存的组织约，置于预先经酒精擦洗的玻璃平皿中，加入约溶液后，用胶玻璃棒轻轻研磨组织至其呈匀浆状，放于冰盒内静置，然后将清亮的匀浆溶液转移至个干净的管中。加氯仿，颠倒混匀，冰浴取上清至另个新的管中，加入异丙醇，反复颠倒混匀数次动作尽量轻柔，放于冰盒内静置弃上清，加水配的乙醇，轻柔地颠倒混匀弃上清，于超净工作台中开盖自然干燥。万方数据三峡大学硕士学位论文加入水，溶解，保存。电泳检测用琼。
2、或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作。
3、抑制浓度为。抗血清的最高效价为，并且利用量子点荧光标记技术，采用斑点印迹方法检测到此阳性血清中的多克隆抗体能够特异性的识别小鼠蛋白，从检测到的结果显示出此抗血清具有较高的特异性敏感度和亲和力。结论获得小鼠肾组织细胞中胞外段基因的片段，通过原核表达实现了小鼠蛋白的高效表达。异源表达的重组蛋白经亲和层析纯化及免疫学实验验证具有抗的抗原表位，用作免疫原的效果理想。制备的单克隆抗体其最小抑制浓度为，而获得的多克隆抗体能特异性的识别原核表达的蛋白，且具有较高的特异性敏感度和亲和力。本研究为进步研究抗单克隆抗体作为种新型的分子佐剂提供了重要的实验材料。关键词融合蛋白单克隆抗体多克隆抗体万方数据三峡大学硕士学位论文。
4、作为抗原免疫小鼠，采集小鼠尾尖血，并取其中效价最高的小鼠血清制备的多克隆抗体将骨髓瘤细胞与分离后的小鼠脾细胞融合，通过间接法筛选经选择性培养基培养的融合细胞，用有限稀释法进行亚克隆，从而最终获得阳性杂交瘤细胞株，此细胞株可稳定分泌特异性抗体。为获得大量单克隆抗体，我们将阳性单克隆细胞移植至经液体石蜡预处理的小鼠腹腔中，采集小鼠腹水上清制备单克隆抗体，用间接检测抗体的效价及特异性。结果经酶切和测序鉴定，采用方法成功地获得小鼠肾组织细胞中胞外段基因的片段，原核表达质粒构建正确。重组质粒转化感受态后，重组蛋白可在条件下被诱导表达，而表达的重组蛋白可以两种形式存在，即包涵体形式，或可溶性形式，。在含尿素的变性。
5、下冷却后方能使用，并于室温保存。与斑点印迹所用溶液用蒸馏水溶解碱，加入约以上的浓盐酸调，最终定容到高压蒸汽灭菌后，冷却，室温保存。用蒸馏水溶解碱，加入约以上的浓盐酸调，最终定容到高压蒸汽灭菌后，冷却，室温保存。称取和，用双蒸水定容至，过滤备用，于棕色瓶中保存。称取分析纯置于玻璃烧杯中，向其中加入约，边加边搅拌，然后放于水浴锅中加热溶解待其在常温条件下冷却后，滴加浓盐酸调节至加定容至，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。过硫酸铵溶于中管分装后，于避光保存，保存两周左右，超期可能会失去催化活性。溴酚蓝，甘油，巯基乙醇，加定容至，保存。，甘氨酸，溶于中，然后加入储存液，再用定容至。室温保。
6、签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的克隆小鼠肾组织中胞外段基因的片段，构建原核表达质粒，然后对重组质粒进行大肠杆菌异源表达纯化和抗原性鉴定，制备小鼠抗的多克隆抗体和单克隆抗体，研究应用抗抗体作为种新型免疫佐剂在抗体研制中的作用与价值。方法首先用方法克隆小鼠肾组织细胞中胞外段基因的片段，将胞外段基因应用重组技术插入到原核表达载体中，构建的原核表达质粒其次将原核表达质粒转化感受态中，经诱导目的基因的高效表达，将所得菌体通过超声裂解，并通过电泳方法检测重组蛋白的表达形式。分别在变性条件及天然条件下采用亲和层析方法纯化目的蛋白，检测纯化情况，间接方法鉴定重组蛋白最后将纯化后经透析复性并浓缩的重组蛋。
7、糖凝胶电泳，无需，样品，检测的纯度及其完整性。在上样孔中有条带，可能有基因组残留。总中有三种的丰度很高，电泳时能形成三条明亮的主带，以此来反映的完整性。在小鼠组织细胞的总中，它们分别是和。若降解，这些条带则会减弱或消失，而低分子量的条带亮度显著增加。检测的浓度和纯度在离心管中，用水将样品稀释倍，以水作为阴性对照。用分光光度仪测定和，以阴性对照归零。个单位相当于，浓度的计算公式如。值大小可反映提取的纯度若值在左右，则表明提取的非常纯净，无其它污染物或残留若值约为，则说明提取的中可能混有少量组织若值约为，则说明提取的非常不纯，可能有其它污染物如蛋白质或乙醇等。计算公式见。逆转录参考公司试剂盒说明书。总加水。
8、齐至。变性。冰浴，加入。退火。加入逆转录酶，总体积。延伸。温浴终止反应。其产物即为第链混合物，保存。扩增目的片段万方数据三峡大学硕士学位论文以为模板，用设计的引物进行。程序仪盖子温度预变性，个循环。的反应体系见表。产物保存于。表反应体系成分体积模板上游引物下游引物聚合酶补齐至取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统记录并分析。质粒构建法制备感受态细胞感受态细胞制备要求所有步骤均在冰上操作，且动作迅速，保持无菌。从冰箱取出甘油菌种，如，室温解冻，三步划线法接种至平皿上。，倒置培养过夜。从培养的平板中用无菌黄枪头挑取个单菌落，转到含有液体培养基，于无菌离心管中培养过夜。第二天早上，向新鲜的液体。
9、用溶液。氮杂鸟嘌呤贮存液称取氮杂鸟嘌呤放入的玻璃烧杯中，向烧杯中加入溶液，用玻璃棒搅拌至其溶解后，再加入超纯水充分混匀，用无菌滤器过滤除菌，按照瓶分装，保存于备用。用溶液加定容于至，调，即用于的磷酸盐缓冲液，保存。用配制的，即洗涤液，临用前配万方数据三峡大学硕士学位论文制。包被缓冲液称取溶解于蒸馏水中，调，即碳酸盐缓冲液，于保存。封闭液即包被缓冲液配制的明胶溶液。抗体稀释液含和明胶的。底物反应缓冲液液过氧化脲，柠檬酸加超纯水定容至，于避光保存。底物反应液液，柠檬酸加超纯水定容至，放于棕色瓶内，于避光保存，现配现用。终止液量取蒸馏水至烧杯中，向烧杯中缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒缓慢搅拌，待其在室温条件。
10、，现配现用。量取，甘油，称取分析纯粉末，溴酚蓝，加入去离子水溶解后定容至，小份分装，保存于室温备用。万方数据三峡大学硕士学位论文考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝置于玻璃烧杯中，向其中加入甲醇，冰醋酸，边加边用玻璃棒搅拌，待其完全溶解后，加超纯水定容至，过滤后于室温条件下保存备用。可反复使用，使用越久染色时间就越长。脱色液量取甲醇，冰醋酸，加超纯水定容至，室温保存。，定容至，滴加浓盐酸调，即斑点印迹或洗涤液临用前配制，或室温保存。牛奶即常用的斑点印迹或封闭液，配制的脱脂牛奶，现配现用。方法基因的克隆以小鼠肾组织细胞的为模板，用技术克隆胞外段基因的片段。引物设计与合成根据中小鼠的序列，设计引物碱基序列为和。。
11、件下，采用亲和层析方法，用咪唑梯度洗脱纯化的重组蛋白以包涵体形式存在，而在非变性条件下用单纯咪唑梯度洗脱纯化的重组蛋白则以可溶性形式存在。经电泳分析目的蛋白的纯度，包涵体形式的蛋白与可溶性形式的蛋白纯度均较高，约为以上，间接鉴定显示重组蛋白具有抗的抗原表位。用尿素变性纯化后复性的目的蛋白免疫小鼠后，将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，然后经筛选和克隆化，获得了株阳性单克隆细胞株，并将其命名为。万方数据三峡大学硕士学位论文对获得的这株阳性杂交瘤细胞进行效价及其抑制的检测，检测到其上清最高效价为，而抑制检测中分别采用五个浓度的蛋白，结果仅浓度的蛋白抑制效果较差，其余个浓度均能有效抑制住上清中的抗体，且最。
12、养基中加入过夜培养的菌液。于，继续培养小时，进入对数生长期。在无菌条件下，在超净工作台内向经提前冰预冷及高压灭菌处理的离心管中加入上述对数生长期的细菌，放于冰盒上静置后。弃上清，吸干残存培养基，加冰预冷的溶液重悬菌体，冰浴。重复次。弃上清，用移液器吸尽残留的液体，用冰预冷的溶液重悬菌体。重悬时动作要轻柔万方数据分类号密级公开硕士学位论文抗单克隆抗体的制备学位申请人朱雅倩学科专业免疫学指导教师杨唐斌教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个。
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