1、自动测序仪，进行测序。分析.寡核苷酸探针针对性寡核苷酸探针用标记和用异硫氰酸荧光素标记准备用于属于.原位检测。另方面，因为没有寡核苷酸探针用于.原位检测，探针最初设计是基于序列在基因数据库访问和核糖体数据库项目检查。根据使用探针对碱基对不匹配数量检查，只有零个.及.或个.不匹配三个生物体被证实，因为它是专门为目标微生物设计。然而，没有纯种污泥可以绑定基因探针。因此,使用污泥杂交样品而不是纯种污泥，进行各种范围杂交温度清洗温度和甲酰胺浓度来优化原位条件和验证关于目标生物探针特异性。.原位杂交污泥样品被固定在多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水溶液.，.,小时。固定污泥样品在中洗涤两次，再悬浮于乙醇溶液，体积个反应器污泥样品中片段图谱。其中存在许多可见光波段，表现出污泥样品中微生物生态学复杂性和多样性。基于各自扩增图谱分析，条带和显示相似片段图谱，然而条带两波段缺失。.考虑图中所描述结果，培养在反应器污泥每磷摄取量在缺氧条件下显著。
2、泥表明不同电子受体条件下每磷吸收能力不同，这透露，负责生物除磷包含至少三个种群包括，微生物群落结构根据电子受体条件而改变。与氧及硝酸盐起培养污泥在缺氧条件下磷吸收量呈大幅上升，这表明小部分能够在有氧条件下利用硝酸盐是存在。扩增结果片段表明，在微生物群落变化取决于不同类型电子受体，系统发育从属关系确定表明，普遍存在于三个反应器中细菌为.属于。分析表明,.在所有反应器中占据相当大比例，尽管电子受体条件彼此不同。参考文献略和.营养液。每升营养液包括以下化合物.,.,.，.,.,.,.,.和。化学分析混合液悬浮固体和磷酸盐分析是依据检验水和废水标准方法来执行。硝酸盐是使用个高效能决定液相色谱仪配备个阴离子柱和个紫外检测器。测量使用分析仪,日本岛津公司,日本。批量实验活性污泥从天后结束有氧或无氧条件下取出,并立即在不包含基础培养基培养液.中清洗两次,。该制备活性污泥分为三部分。其中两部分被孵育在合成废水和没有氮烯丙基硫脲下。
3、提供了个基础凝胶系统识别相应细菌对应条带以及设计有针对性寡核苷酸探针荧光原位杂交分析,即使这些细菌是非可培养。本研究目是表征不同电子受体栽培条件下,在此基础上,采用和法分析微生物群落结构亲缘关系改变和识别执行生物除磷。.材料和方法反应器运行三个序批式反应器各.工作容积，提供了三种不同电子受体，即，氧气和硝酸盐反应器，无硝酸盐反应器，仅硝酸盐反应器，分别运行了天获得负责生物除磷。如表所示，和反应器在厌氧好氧条件下运行，而反应器在厌氧缺氧条件下运行。在运行反应器之前，从东京个市政污水处理厂好氧反应池取出活性污泥是接种过。在接种之前，这些污泥缺氧吸磷能力采用硝酸盐作为电子受体进行了评估。其结果是，总有机碳被完全吸收并且磷在厌氧条件下释放，且在随后缺氧条件下观察到，磷吸收利用硝酸盐作为电子受体。所有反应器运行周期为,包括个分钟填充阶段,分钟厌氧阶段,分钟有氧或缺氧阶段,分钟沉降阶段和分钟退出阶段。个周期后,.流出量与相同。
4、含在所有反应器中细菌通常是.同源性和.同源性，基于从条带切下序列及测定亲缘关系分析得出，它们属于。然而，在所有反应器中只有.存在被荧光原位杂交分析所证明。爱思唯尔科技有限公司保留所有权利。关键词核糖体变性梯度凝胶电泳反硝化聚磷菌强化生物除磷荧光原位杂交聚磷菌聚合酶链反应.介绍在过去几十年，生物脱氮除磷法被广泛用于处理废水中含有营养物质,即氮和磷,以及化学需氧量,因为与化学处理方法相比它有经济优势。由于磷是限制藻类大量繁殖养分，以聚磷菌为特点强化生物除磷工艺直被视为防止水体富营养化种手段。然而，工艺与生物脱氮工艺比有个缺点，因为在低比时作为磷释放和反硝化作用个限制因素。如果是这样话,最合适解决关于限制影响方案是将反硝化聚磷菌引入到过程,这样能够利用硝酸盐作为电子受体来同时去除废水中磷和氮。在过程使用另个优势是使用硝酸盐而不是氧作为电子受体结果是更少数量污泥产生以及有效地利用因此，硝酸盐，产生有氧条件下硝化过程中，已。
5、自所有反应器活性污泥运行在分钟厌氧条件和后续分钟好氧或缺氧条件下,在不同电子受体状况下磷吸收能力能够被调查和评估。分析.取样和制备在每个反应器中污泥样品采自有氧或缺氧条件下，应立即通过在离心浓缩分钟，然后与体积体积重量缓冲液.中旋转分钟。上述污泥样品准备工作重复次，然后存储在。.提取所制备污泥样品悬浮于体积体积重量缓冲液蔗糖，.氯化钠乙二胺四乙酸二钠.其中含有溶菌酶，然后进行超声波处理秒。后在离心分离分钟回收水相。如上所述，回收水相重复三次。所回收水相，在.体积重量体积蛋白酶，用.体积重量体积钠，随后用.体积重量体积，每次分钟，在培养。在,下离心分钟后，被转移到个新管水相中用个相同体积溶液酚氯仿异戊醇，体积体积体积和溶液氯仿异戊醇，体积体积提取，然后沉淀在.体积醋酸钠值.和.倍体积无水乙醇中。沉淀通过用体积体积乙醇洗涤并在干燥干燥器方式获得。最后，将干燥沉淀重新悬浮于缓冲液中，并储存在。.扩增大肠埃希氏菌和位置相。
6、分别在厌氧条件下,然后被暴露于有氧条件。另部分在厌氧条件下与无氮烯丙基硫脲合成废水中孵育后被暴露在缺氧条件下。对于缺氧中文字出处附录使用聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳法测定不同电子受体条件下反硝化聚磷菌特征,化学工程学系,早稻田大学东京新宿,东京,日本年月日接收年月日接收修订版年月正式收录摘要为了调查反硝化聚磷菌特点以及微生物多样性，能够使用硝酸盐作为电子受体进行强化生物除磷，三序批式反应器都工作在三个不同电子受体条件，即只有氧气，氧气和硝酸盐以及只有硝酸盐。根据关于每个反应器中生物化学转化化学分析，人们发现，负责强化生物除磷聚磷微生物包含至少有三个种群包括，并根据微生物群落结构改变电子受体条件。此外，与氧及硝酸盐培养污泥在缺氧条件下磷摄取量呈急剧增加，这表明在有氧条件存在定比例能够利用硝酸盐。另方面，微生物群落结构依靠不同电子受体而改变已经通过变性梯度凝胶电泳聚合酶链反应扩增核糖体片段结果分析得到证明。结果发现，。
7、少，似乎条带波段和缺失与数量减少有关，因为在有氧条件下硝化作用受到抑制。另个方面，与其他条带相比较，条带图谱由于氧缺乏和硝酸盐存在有显著变化其表现为五个新波段，和出现和六个波段及缺失，而在条带和中均含有，这结果表明，参与生物除磷微生物群落可以根据电子受体条件而改变。如图所讨论，每个反应器中展现了不同电子受体条件下每磷不同吸收能力下，这表明，磷吸收能力与根据电子受体条件而改变微生物群落结构有关。因此，结果表明，些图谱可见光波段与微生物群落结构改变有关。我们最初预期，反应器微生物群落结构多样性减少，因为当硝酸盐被单独提供作电子受体时，能够仅利用氧数量将减少。然而，与最初预期相反，条带显示出比其他条带更加复杂波段图谱。因此，反应器结果也似乎与微生物群落结构改变有关。基于波谱分析，可以看出，波段和普遍出现在所有条带中。因为尽管运行在不同电子受体条件下，所有反应器表现出同时利用氧和硝酸盐来吸收磷能力，波段和可能对应能够同时。
8、用氧和硝酸盐作为电子受体。因此，将波段和从聚丙烯酰胺凝胶剪下，然后分析它们序列。进步，将所得到序列与基因库比对，然后确定其所属关系。图三个反应器中图谱片段条带接种体，条带反应器,条带反应器,条带反应器。图从图谱切下系统发育树。进化距离和简约分析采用重采样在进行。这规模表示.核苷酸替换每个核苷酸位置。该树是根植于以为基础序列。使用分析法原位检测优势物种和测序结果表明，.，候选种类之，普遍存在于所有在不同电子受体条件下进行强化脱氮除磷反应器中。尽管如此，从电泳中获得图谱并未给出任何信息关于微生物群落结构优势程度。因此，分析法检测了.和.,因为原位杂交中使用针对性寡核苷酸探针能够识别和监控微生物群落结构中特殊菌种。图和显示.图像,具体为在反应器污泥样品寡核苷酸探针。.在使用红色和绿色探测原位双杂交中显示出明显黄色信号，这结果证明了在反应器中占据相当大比例。此外,其他反应器分析还表明,与反应器数据未显示样，.是大量存在。。
9、探针。因此,使用污泥杂交样品而不是纯种污泥，进行各种范围杂交温度清洗温度和甲酰胺浓度来优化原位条件和验证关于目标生物探针特异性。.原位杂交污泥样品被固定在多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水溶液.，.,小时。固定污泥样品在中洗涤两次，再悬浮于乙醇溶液，体积和.营养液。每升营养液包括以下化合物.,.,.，.,.,.,.,.和。化学分析混合液悬浮固体和磷酸盐分析是依据检验水和废水标准方法来执行。硝酸盐是使用个高效能决定液相色谱仪配备个阴离子柱和个紫外检测器。测量使用分析仪,日本岛津公司,日本。批量实验活性污泥从天后结束有氧或无氧条件下取出,并立即在不包含基础培养基培养液.中清洗两次,。该制备活性污泥分为三部分。其中两部分被孵育在合成废水和没有氮烯丙基硫脲下,分别在厌氧条件下,然后被暴露于有氧条件。另部分在厌氧条件下与无氮烯丙基硫脲合成废水中孵育后被暴露在缺氧条件下。对于缺氧条件下,硝酸盐溶液开始时添加。通过这种方式,分批实验利用取。
10、应区域扩增使用正向引物与夹在端部建立稳定片段熔化行为和反向引物。扩增以自动热循环仪基因扩增系统，应用生物系统公司，美国使用以下协议进行初始变性分钟，周期变性分钟,退火分钟,扩展分钟,紧随其后是最后个扩展为分钟在。混合物最终体积为，其中含有缓冲液，.，引物各.，.，模板和聚合酶。扩增后，产物用重量体积琼脂糖凝胶在，电泳分钟，然后在被装上变性聚丙烯酰胺凝胶前进行溴化乙锭染色检查。.电泳根据制造商说明,使用通用突变检测系统，。产物在聚丙烯酰胺凝胶上缓冲液中，.电泳，在和进行分钟，该凝胶包含从到线性梯度变性剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳后用生物制品，编号染色分钟，然后用数码相机直观显示在紫外透射仪下，。.测序从聚丙烯酰胺凝胶中切下两个条带进行片段测序。切下来片段使用凝胶提取试剂盒，纯化，然后用无夹正向引物和反向引物进行扩增。扩增后，产物使用快速纯化试剂盒，纯化。按照制造商说明，两股纯化扩增产物被引物和通过大终结者周期测序试剂盒，。
11、认为是另个电子受体用于同时去除氮和磷而无需额外补充细胞外碳基质。最近,为了考虑能够通过使用硝酸盐缺氧吸磷代替氧作为电子接受体比例，在反硝化活动中引入活性污泥模型.任务组。然而,个从微生物角度详细了解是缺乏。这是主要是因为在技术中参与关键化学转化反应目前为止还不能使用传统培养技术来培养。几个研究报告称,通过几个分子技术检测到属于。然而,这些研究仅限于高磷在厌氧好氧积累能力条件。因此,为确定在工艺过程中负责缺氧除磷,我们采用聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳法，该法已被广泛认为是研究微生物生态学个强大工具。变性梯度凝胶电泳法是基于在电泳扩增核糖体在聚丙烯酰胺凝胶碎片中含有个线性增加变性梯度。不同条带是分离，根据具有相同长度但不同序列产物融化行为，分别对应相应物种。因此,测定允许我们分析个给定系统微生物组成和多样性而不需要分离单个物种,。这是特别有效分析非可培养环境微生物群落结构样品如工艺中微生物。此外,从凝胶切除条带序列分。
12、外，图片形态学观察揭示出在原位杂交中使用探针绿色形成了串串类似葡萄似图案，如图所示，并且在形态学上与其他反应器相似。这结果表明，类似微生物从聚丙烯酰胺凝胶分离出部分序列能够兼性利用氧和硝酸盐作为电子受体吸收磷，因此在不同电子受体条件下强化生物除磷中其重要作用。然而,使用探针杂交表明,并不大量存在于所有反应器数据未显示污泥样品，这表明并非是所有反应器优势种群,虽然它检测是通过。这很可能是因为从污泥样品提取.通过通用引物方法被夸张地放大，尽管它是比例很小微生物群落。因此，分析表明，.在所有以醋酸盐作为碳源所有反应器中是存在，即使电子受体条件彼此不同。图反应器污泥样品中特定寡核苷酸探针.图像。污泥样品图像采用绿色标记探针单杂交，采用绿色和红色标记探针双杂交。黄色代表.，其他颜色代表其他细菌，。.结论在本文中,我们提出能够利用硝酸盐作为电子受体进行缺氧磷吸收特点和微生物多样性。从这项研究中,得到以下结果从每个反应器中获得。
参考资料：
（外文翻译）使用聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳法测定不同电子受体条件下的反硝化聚磷菌的特征（外文+译文）