1、检血清的边缘,则判定此孔的被检血清为阴性。酶联免疫吸附试验之红细胞混匀,水浴,离心判定当阳性血清孔和红细胞对照出现抑制溶血,阴性血清对照孔抗原对照孔补体对照孔及被检血清对照孔均出现溶血时判定被检血清结果。对比标准溶血孔对被检血清管进行判定不溶血,不溶血,不溶血,不溶血,溶血。被检血清∶稀释时大于或等于抑制溶血为阳性,小于抑制溶血为阴性。在进出境动物检疫中,对判定标准有规定的按规定执行。犛犖犜附录犃规范性附录染色液与培养基的配制犃萋尼氏染色犣犻犲犺犾犖犲犲犾狊犲狀抗酸染色法犃染色液犃石炭酸复红液取碱性复红,溶于酒精中,制成饱和液成为复红原液,取复红原液份,加石炭酸水溶液份,混合,。

2、剂设备扩增仪低温高速离心机电泳仪凝胶成像分析系统冰箱生物安全柜电泳槽。材料可调微量移液器离心管和脂糖凝胶溴化乙锭溶液见。操作步骤样品的制备标准菌株副结核分枝杆菌由国家指定单位提供。粪便称取新鲜粪便,加,混匀,放置或室温离心,取上清液,室温放置或室温再次离心,取上清液,室温离心,弃上清液,加入。奶样无菌操作取奶加,混匀,室温离心,弃上清液,管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉,加入。犇犖犃模板的提取水浴加热,冷至室温。加溶菌酶,气浴振荡培养。加蛋白酶,混匀,水浴加热。加和预热的,上下颠倒混匀,直至液体变为白色奶状,水浴加热。加氯甲烷异戊醇∶,混匀,室温离心。取上层水相于新管,加等体积的氯。

3、样在中央孔中加入抗原,待检血清阳性对照血清和阴性对照血清加到周围孔中如图。加样后静止,将平皿倒置放入湿盒内,置室温下感作,和观察并记录结果。犛犖犜判定结果将琼脂板置观察灯下或侧强光下观察,标准阳性血清与抗原孔之间出现条清晰致密的白色沉淀线,则判定试验成立。阳性若被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线,并与标准阳性血清的沉淀线末端相融合,则判定被检血清为阳性。弱阳性若被检血清孔与中心抗原孔之间没有出现沉淀线,但两侧标准阳性血清形成的沉淀线向被检血清孔的内侧弯曲,则判定此孔的被检血清为弱阳性。阴性若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线,相邻的标准血清与抗原之间的沉淀线直伸到被。

4、。将平板放入水平电泳槽中,加入补足至反应总体积为注反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。犘犆犚扩增产物电泳检测用电泳缓冲液配制成琼脂糖平板溴化乙锭终浓度。将平板放入水平电泳槽中,加入电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面,将扩增产物与上样缓冲液混合,加入样品孔中,取加入到标准分子量对照孔内。恒压电泳。凝胶成像分析系统检测并记录结果。结果判定及表述后,阳性对照会出现条的片段,阴性对照和空白对照没有核酸带,待检样品中如出现的片段为检测结果阳性,即检出副结核分枝杆菌。如未出现的片段犛犖犜为检测结果阴性,即未检出副结核分枝杆菌。序列参见附录。聚合酶链犘犆犚反应之嵌套式犘犆犚设备材料和试。

5、解,水浴灭能,并用巴比妥缓冲液作按∶,∶,∶稀释。标准阴性血清由指定单位提供,冻干品,使用时按说明用蒸馏水溶解,按水浴灭能,并用巴比妥缓冲液作按∶,∶,∶稀释。被检血清从牛静脉采血,分离血清,不能产生溶血,保存。采血应与皮内变态反应同天进行,若需重复采血,则第次采血应在皮试后内进行。水浴灭能。使用前用巴比妥缓冲液按∶,∶,∶稀释后。犛犖犜绵羊红细胞悬液的制备采健康成年绵羊血,以∶的比例与阿氏液混合,在保存后使用。使用前摇匀后取出需量,用倍量巴比妥缓冲液洗涤次,每次小心加入体积的异丙醇沉淀核酸,小心手摇混匀,放置,室温离心。弃上清液,加入预冷的的乙醇,室温离心,弃上清液。图打孔式样加。

6、滤液过滤。犃盐酸酒精取浓盐酸,加酒精,混合均匀。犃碱性美蓝染色液取美蓝,加入溶解制成饱和液成为美蓝原液,取原液加入氢氧化钾液,混合,滤纸过滤。犃染色方法犃取制好的涂片在酒精灯火焰上固定,以其背面再注射次。如果注至皮下或溢出,应于离注射点以外补注针,并在记录中加以说明。尾根部接种将尾巴托起,在尾根左侧或右侧无毛的皱褶部进行皮内注射。接种方式同。判定结果在接种后分别于检查注射部位有无热肿痛等炎性反应,并以卡尺测量接种部位捏褶皮肤厚度。颈部接种后于皮肤厚度减去接种前皮肤厚度,皮厚增加以上时,迟发型变态反应阳性,皮厚差为阴性。尾根部在接种后分别于观察并触摸接种部位,进行终判,肿胀者为阳性,。

7、甲烷∶异戊醇∶,混匀,室温离心。犛犖犜取上层水相于新管,小心加入体弃掉包被板各孔的液体,每孔加入约工作浓度的洗板液,按所选试剂盒要求的次数清洗微孔。最后次清洗后,将包被板在吸水纸上轻拍,以去掉孔内剩余的液体。加酶标结合物按所选试剂盒要求,每孔加入工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体。感作将包被板在振荡器上充分混匀后,按所选试剂盒要求的温度和时间进行感作。洗板重复的操作。加底物按所选试剂盒要求,每孔加入底物溶液。加入底物后,应观察所孔内的颜色变化是否正常。不正常的颜色变化包括孔内出现点状或片状的沉淀物。如果出现这种情况,这个孔的样品检测为无效。操作步骤两种接种途径颈部接种将颈部左侧或右。

8、,混匀,室温离心。取上层水相于新管,加等体积的氯甲烷∶异戊醇∶,混匀,室温离心。犛犖犜取上层水相于新管,小心吸走液体,室温下干燥左右,用溶解,保存。犘犆犚法引物正向引物反向引物扩增副结核分枝杆菌基因中的片段。扩增程序及反应条件变性,退火,延伸,共个循环。反应体系犔设立阳性对照阴性对照和空白对照,用副结核标准菌株的模板作阳性对照,用其他非副结核杆菌的模板做阴性对照,用水作空白对照模板。见表。表犘犆犚反应体系试剂名称用量缓冲液不含氯化镁犜犪狇酶模板补足至反应总体积为注反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。犘犆犚扩增产物电泳检测用电泳缓冲液配制成琼脂糖平板溴化乙锭。

9、侧中分之处将毛剪净,剪毛区直径约。将接种部位皮肤捏起,用卡尺测量捏褶皮肤的厚度,并做记录,皮厚单位用毫米表示。用酒精棉球消毒接种部位,用注射器吸取副结核菌素,与接种部位呈的角度进行皮内注射,注射部位应出现鼓包或隆起,若无小鼓包则应在另侧颈部相应部位再注射次。牛副结核病检疫技术规范.在酒精灯火焰上来回通过数次,略作加热但不能太热,以不烫手背为度进行固定。犃将涂片放在染色架上,滴满石炭酸复红液,用酒精灯在玻片下加热,以冒蒸汽而不沸腾为度,稍冷,倾去染色液。犃加盐酸酒精脱色至玻片无红色约为。犃水洗,滴加碱性美蓝液,染色,水洗,干燥。标准阳性血清由指定单位提供,冻干品,使用时按说明用蒸馏水。

10、蛋白酶和,下孵育,观察是否透明,若不透明补加,下孵育冰上冷却后,加入等体积的苯酚氯甲烷摇动,离心取上清液,加等体积的氯甲烷异戊醇摇动离心缓冲液琼脂糖凝胶溴化乙锭溶液见。操作步骤样品的制备标准菌株副结核分枝杆菌由国家指定单位提供。粪便称取新鲜粪便,加,混匀,放置或室温离心,取上清液,室温放置或室温再次离心,取上清液,室温离心,弃上清液,加入。奶样无菌操作取奶加,混匀,室温离心,弃上清液,管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉,加入。犇犖犃模板的提取水浴加热,冷至室温。加溶菌酶,气浴振荡培养。加蛋白酶,混匀,水浴加热。加和预热的,上下颠倒混匀,直至液体变为白色奶状,水浴加热。加氯甲烷异戊醇∶。

11、终浓度。将平板放入水平电泳槽中,加入岁岁时才表现临床症状,在岁岁以后的任何年龄的牛均可发生本病,特别当牛怀孕分娩或泌乳时易出现症状。病牛和隐性感染牛是传染源,它们可通过乳汁粪便和尿排出大量病原菌。本病常呈散发或地方性流行,主要经消化道感染,也可通过子宫感染胎儿。该病的流行特点是发展缓慢,发病率不高,病死率高,感染牛群的死亡率可达,甚至可达。临床症状发病初期没有明显症状,以后症状逐渐明显,开始是间歇性腹泻,其后逐渐严重和频繁,重者粪便如水样,喷射状排出或稀粥样,含有蛋白凝块气泡和多量黏液,偶见血丝。早期精神食欲泌乳无明显改变,以后食欲减退,精神不佳,泌乳减少或停止。患畜逐渐消瘦,体力。

12、肿胀者为阴性。犛犖犜聚合酶链犘犆犚反应之设备材料和试剂设备扩增仪高速冷冻离心机超净工作台旋涡振荡器凝胶成像分析系统恒温水浴振荡器磁力搅拌器天平消毒灭菌锅高温干燥箱冰箱。材料可调微量移液器离心管和吸头用水处理后高压灭菌备用。试剂缓冲液缓冲液溶菌酶蛋白酶蛋白酶见。氯甲烷异戊醇异丙醇乙醇。电泳标准菌种由指定单位提供。引物的设计针对基因设计合成两对引物第次扩增上游引物,下游引物片段大小为第次扩增上游引物,下游引物片段大小为。引物均配制成,保存。细菌的培养按照进行细菌培养。犇犖犃提取取菌苔湿重振荡悬浮于溶液中,室温静置离心,沉淀用悬浮,离心离心沉淀用悬浮,加溶菌酶下孵育,加入。

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