1、对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照致的扩增条带，判定结果为阴性。试剂试剂见。烟草环斑病毒检疫鉴定方法。包被缓冲液见。缓冲液见。反转录及试剂见。反转录酶。结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放人装有止的溴化乙锭溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。结果判断阳性对照在左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照致的扩增条带，判定结果为阴性。试剂试剂见。实验步骤附录规范性附录实时荧光检。基因组病毒基因组含两条。长，长，外壳蛋白基因。试剂附录规范性附。

2、见。反转录聚合酶链式反应检测试剂见。实时荧光值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做次，或用其他方法加以验证。样品。值阴性对照值明显，判为阴性。若满足不了质量要求，则不能进行结果判断。试剂附录规范性附录检铡氯甲烷异丙醇乙醇。反转录试剂反转录酶以反应缓冲藏混合液各。烟草环斑病毒检疫鉴定方法。囝圄中华人民共和国国家标准烟草环斑病毒检疫鉴定方法发布实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘刖缓冲液洗涤缓冲液加入蒸馏水溶解，用或调节值到，蒸馏水定容至。每升中加入的。酶标抗体稀释缓冲液牛血清白蛋白或脱脂奶粉用或调节值到，储存。底物缓冲液乙醇胺溶于蒸馏水中，用调值至，蒸馏水定容至。储存。程序包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，孔，加盖，室温避光。

3、容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。结果判断阳性对照在左右处有盖，室温避光孵育，清空酶联板孔中溶液，洗涤次次。加底物将底物加入到底物缓冲液中使终浓度为现配现用，按孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。读数用酶联检测仪在和于处读值。结果判断对照孔的值缓冲液孔阴性对照及阳性对照孔，应该在质量控制范围内，即缓冲液孔和阴性对照孔的值孔的重复性基本致。在满足了质量要求后，结果原则上可判断如下样品值阴性对照。值明显，判为阳性。样品值阴性对照值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做次，或用其他方法加以验证。样品。值阴性对照值明显，判为阴性。若满足不了质量要求，则不能进行结果判断。试剂附录规范性附录检铡氯甲烷异丙醇乙醇。反转录扩增片段，阴性对照和空。

4、液用或调节值到。储存。包被缓冲液。加入蒸馏水溶解，用调节值到，蒸馏定容至。储存。缓冲液洗涤缓冲液加入蒸馏水溶解，用或调节值到，蒸馏水定容至。每升中加入的。酶标抗体稀释缓冲液牛血清白蛋白或脱脂奶粉。缩写。属豇豆花叶病毒科，线虫传多面体病毒属病毒。的传播途径多样，可以通过种子嫁接机械接种和介体传播。烟草环斑病毒其他信息参见附录。方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定体外反转录和体外合成技术的反转录聚合酶链式反应进行检测鉴定。仪器设备用具及试剂仪器设备洗板机酶联检测仪高速冷冻离心机电子天平感量超净工作台旋涡混合仪仪实时荧光仪电泳仪电泳槽紫外透射仪榨汁机水浴锅。用具微量移液器弘化学反应管和或孔光化学反应板酶联板研钵。试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂。

5、此外在实验室条件下确定能传播的昆虫介体有许多，如烟蓟马和烟草跳甲等。血清学特性免疫原性强。粒体形态病毒粒体为等轴十面体球状颗粒，直径约。加入等体积异丙醇，混匀，静置，离心，弃上清液。加入冷乙醇，悬浮沉淀，离心，干燥沉淀。加入处理的。，溶解沉淀必要时，水浴，加速溶解，于保存备用。洼也可按照商阴性对照以。代替模板作为空白对照。每个对照各做个平行管。表实时荧光反应体系加样量名称贮备液浓度终维度缓冲液酶探针补至实时荧光反应参数反应条件，共个循环。点击运行，进行反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出荧光信号增加值与循环数之间关系的图像。结果判定检测样品的值大于或等于时，则判定烟草环斑病毒阴性。结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放人装有止的溴化乙锭溶液的。

6、录双抗体夹心酶联免疫吸附测定包被抗体特异性的烟草环病毒抗体。酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的烟草环斑病毒抗体。底物对硝基苯磷酸钠样品抽提缓冲液用或调节值到。储存。包被缓冲液。加入蒸馏水溶解，用调节值到，蒸馏定容至。储存。缓冲液洗涤缓冲液加入蒸馏水溶解，用或调节值到，蒸馏水定容至。每升中加入的。酶标抗体稀释缓冲液牛血清白蛋白或脱脂奶粉检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。寄主范围附录资料性附录烟草环斑病毒简介自然寄主范围非常广泛，可侵染科多种植物，主要的经济作物有大豆马铃薯甘薯烟草西瓜黄瓜甜瓜胡萝唐菖蒲李属葡萄等。病害症状因寄主不同可产生不同的症状，般在生长季节初始，幼嫩植株上的症状较严重，而在生长季节后期不太明显。造成叶片系统褪绿斑坏死环斑，茎顶枯，根腐烂。

7、孵育或冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，洗涤次次。样品制备待测样品按重量体积加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆离心，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照阳性对照作相烟草环斑病毒检疫鉴定方法.提取试剂盒进行操作。囝圄中华人民共和国国家标准烟草环斑病毒检疫鉴定方法发布实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘刖罱本标准按照给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位中华人民共和国厦门出入境检验检疫局中华人民共和国上海出入境检验检疫局中华人民共和国深圳出人境检验检疫局中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人陈青林石明杨翠云张毅陈红运廖富荣郑云李斌。范围烟草环斑病毒检疫鉴定方法本标准规定了。

8、为阴性。试剂试剂见。烟草环斑病毒检疫鉴定方法。包被缓冲液见。缓冲液见。反转录及试剂见。反转录酶。结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放人装有止的溴化乙锭溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。结果判断阳性对照在左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照致的扩增条带，判定结果为阴性。试剂试剂见。实验步骤附录规范性附录实时荧光检提取试剂盒进行操作。囝圄中华人民共和国国家标准烟草环斑病毒检疫鉴定方法发布实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘刖罱本标准按照给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归口。

9、草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子苗木鳞球茎组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。规范测引物设计引物序列探针序列提取及反转录操作方法见。实时荧光反应体系实时荧光反应体系见表，每个样品设个平行处理。并设阳性对照阴性对照和空白对照，以含有烟草环斑病毒的为阳性对照以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的作为阴性对照以。代替模板作为空白对照。每个对照各做个平行管。表实时荧光反应体系加样量名称贮备液浓度终维度缓冲液酶探针补至间变短。叶小且扭曲植株矮小产果少且变形。分布地区在日本韩国印度中国地区美国土耳其加拿大墨西哥阿根廷巴西澳大利亚新西兰等多个国家和地区均有分布。传播途径在大豆上的种传率有时可达到。主要的传播介体为美洲剑线虫。。

10、植物产品的检测鉴定植物产品有实时荧光反应参数反应条件，共个循环。点击运行，进行反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出荧光信号增加值与循环数之间关系的图像。结果判定检测样品的值大于或等于时，则判定烟草环斑病毒阴性基因组病毒基因组含两条。长，长，外壳蛋白基因。试剂附录规范性附录双抗体夹心酶联免疫吸附测定包被抗体特异性的烟草环病毒抗体。酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的烟草环斑病毒抗体。底物对硝基苯磷酸钠样品抽提缓冲液用或调节值到。储存。包被缓冲液。加入蒸馏水溶解，用调节值到，蒸馏定容至。储存。扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照致的扩增条带，判定结果。

11、。本标准起草单位中华人民共和国厦门出入境检验检疫局中华人民共和国上海出入境检验检疫局中华人民共和国深圳出人境检验检疫局中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人陈青林石明杨翠云张毅陈红运廖富荣郑云李斌。范围烟草环斑病毒检疫鉴定方法本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子苗木鳞球茎组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。规范烟草西瓜黄瓜甜瓜胡萝唐菖蒲李属葡萄等。病害症状因寄主不同可产生不同的症状，般在生长季节初始，幼嫩植株上的症状较严重，而在生长季节后期不太明显。造成叶片系统褪绿斑坏死环斑，茎顶枯，根腐烂，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复，表现为无症带毒。大豆顶芽卷曲芽枯萎。

12、，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复仪电泳仪电泳槽紫外透射仪榨汁机水浴锅。用具微量移液器弘化学反应管和或孔光化学反应板酶联板研钵。试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂见。反转录聚合酶链式反应检测试剂见。实时荧光检测试剂见。检测试剂见。种苗的检测鉴定种子检测鉴定挑取粒种子重点挑取畸形不成熟的种子播于灭菌土中，待长出片片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组株为组并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形不成熟的种子直接进行酶联铡定和分子生物学检测。苗木组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同。鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。

参考资料：

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