1、向转录产物即为第链。保存备用。半定量反应上面所得的作为模板，继续扩增，扩增体系为，以管家基因为内参照，对样品模板用量标准化。基因引物设计表是参照文献由上海捷瑞生物有限公司合成。为内参照,其序列由上海捷瑞生物有限公司设计及合成。引物序列大小，反应条件，产物大小见表表基因引物序列，反应条件及产物大小基因引物序列退火温度产物大小表反应体系试剂体积模板上游引物下游引物万方数据三峡大学硕士学位论文酶补到表基因的反应条件基因温度和时间循环变性退火延伸结果检测将配置好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中。

2、合成。引物序列大小，反应条件，产物大小见表表基因引物序列，反应条件及产物大小基因引物序列退火温度产物大小关蛋白基因甲基转移酶腺苷甲硫氨酸四甲基偶氮唑盐比色法流式细胞术分泌型卷曲相缩略英文全称中文全称胞苷二磷酸逆转录蛋白印记技术综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文结果讨论小结参考文献大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法万方数据三峡万方数据三峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法结果讨论小结参考文献综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文。

3、量取电泳缓冲液，在三角烧杯内混合后微波炉加热使之溶化，当琼脂糖液温度降至左右时，加入溶液，轻摇混匀，将梳子插好后倒胶，室温静置，待完全凝固后，拔出梳子，放入已加入新鲜电泳缓冲液的电泳槽内取样品，混匀后上样电压，电泳时间电泳完成后，用凝胶分析系统观察结果。检测的表达状态逆转录合成将上述测好浓度的组样本，均采用定量，不足部分使用水补足，装入反应管后置于冰上。每管加入及反转录试剂盒内的，使总反应体系达到，置于下，反应反应结束后，每管加入，，，，置于，反应后，置于，反应。。

4、电泳完成后，用凝胶分析系统观察结果。检测的表达状态逆转录合成将上述测好浓度的组样本，均采用定量，不足部分使用水补足，装入反应管后置于冰上。每管加入及反转录试剂盒内的，使总反应体系达到，置于下，反应反应结束后，每管加入，，，，置于，反应后，置于，反应。反向转录产物即为第链。保存备用。半定量反应上面所得的作为模板，继续扩增，扩增体系为，以管家基因为内参照，对样品模板用量标准化。基因引物设计表是参照文献由上海捷瑞生物有限公司合成。为内参照,其序列由上海捷瑞生物有限公司设计及。

5、复此操作两次小心弃上清。小离心机上低速离心，用微量移液器尽量吸去上清，将离心管置于冰上后放入通风柜干燥，沉淀用水溶解，保存备用。测定浓度将核酸蛋白分析系统开机预热调到紫外线光，照射机器半小时方可开始测浓度。戴手套取出石英比色皿，勿接触透光面，然后用水小心清洗石英比色皿，用水标定调零。取和水共，上紫外分光光度仪测浓度。原溶液浓度。测定其比值大于可用于。万方数据三峡大学硕士学位论文琼脂糖凝胶电泳检测完整性彻底清洗干净电泳槽，最后用水润洗两遍电泳槽配制琼脂糖凝胶精确称取琼脂糖粉，。

6、精确量取产物和，二者充分混匀后进行点样在电压下，电泳，待电泳完成后，用凝胶分析系统观察结果。本部分实验运用进行单因素方差分析，当表示差异具有显著意义。法检测直肠癌细胞内基因表达状态将生长状态良好的细胞用胰酶消化并配成细胞悬液，均匀种植到，号培养瓶中细胞贴壁后进行换液处理，各组添加液中的胎牛血清浓度为。号培养瓶中加入的培养基，号培养瓶中加入等体积的药液，号培养瓶中加入等体积的药液，号培养瓶中加入等体积的药液将四瓶细胞同时放入细胞培养箱，培养小时后弃去药液，然后用胰酶消化细胞使其脱离培。

7、略英文全称中文全称胞苷二磷酸逆转录蛋白印记技术四甲基偶氮唑盐比色法流式细胞术分泌型卷曲相关蛋白基因甲基转移酶腺苷甲硫氨酸低糖培养基溴化乙锭焦磷酸二乙脂磷酸盐缓冲液胎牛血清二甲基亚砜碘化丙啶十二烷基磺酸钠胰蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸万方数据三峡大学硕士学位论文血管内皮生长因子，用的润洗遍，将细胞分为对照组和实验组，对照组加入培养基，实验组加入浓度的中药成分，将培养瓶移至恒温培养箱培养。培养后，在超净工作台内，用预冷的的轻柔洗涤细胞两遍。弃去废液，细胞瓶倒置在滤纸上，尽量将水吸干。提取测。

8、万方数据三峡大学硕士学位论文中药成分处理直肠癌细胞的变化倒置显微镜观察发现药物处理前各组细胞呈类椭圆形，部分呈梭形，贴瓶壁生长在处理后，实验组细胞生长明显受到抑制，且随浓度的逐渐增加，细胞密度逐渐下降异形变态细胞逐渐增多，细胞核皱缩成团，细胞体积缩小，并出现空泡现象，此现象组比组更明显，对照组细胞轮廓清晰，细胞间接触紧密，细胞形态饱满，生长良好见下图。流式细胞术测定中药成分对细胞周期的影响用不同浓度的中药成分和处理细胞后，用流式细胞仪检测发现与对照组比较，中药成分可以使期细胞增多使。

9、浓度检测完整性用法提取每瓶细胞加入的，放冰上置，用细胞刮刮取细胞，用移液枪充分吹打混匀，将混合液分别吸至个经水处理过的的离心管中，室温下静置左右。以下整个操作均在冰上完成每个的离心管中加入氯仿，盖紧离心管盖，涡旋器上剧烈摇荡后可见絮状物析出。将管静置后离心离心后，可见溶液分成层，上层为。将的离心管的上清液体吸至另外个经水处理过的的离心管吸取时宁少勿多，勿将中间的蛋白层吸入，加入的异丙醇，混匀后室温静置，用手颠倒混匀后离心弃去上清，每管分别加入用水配置的乙醇，充分震荡后，离心。。

10、洗次，每次约分钟，法显色，扫描成像系统分析光密度值。本部分实验运用进行单因素方差分析，当表示差异具有显著意义。万方数据三峡大学硕士学位论文实验结果中药成分对细胞增殖的抑制作用结果显示，不同浓度的中药成分处理后，随着时间延长，细胞增殖较对照组明显减缓随着浓度的增加，抑制效应具有增强趋势，对细胞的生长具有抑制作用，且呈浓度梯度依赖性。浓度时抑制率改变明显因此将此浓度作为高剂量实验组，浓度作为中低剂量实验组。表检测不同浓度的对细胞生长的影响,中药成分生存率图不同浓度的处理直肠癌细胞生长曲。

11、胞阻滞于期，差异具有统计学意义，使期细胞有减少的趋势。表中药成分对直肠癌细胞细胞周期作用,药物浓度各细胞周期所占比例期期期万方数据三峡大学硕士学位论文图中药成分对细胞细胞周期作用对照组处理组处理组处理法检测中药成分对直肠癌细胞基因表达的影响检测纯度和完整性所提取细胞，为确定是否被污染经紫外分光光度仪检测其,其比值为可用于。琼脂糖凝胶电泳可见的三条带，表明抽提的完整，可用于。万方数据分类号密级公开硕士学位论文中药成分对直肠癌细胞增殖的影响及其机制研究学位申请人梁云学科专业外科学指导教。

12、瓶壁，用移液器吹打，转入离心管，转每分离心分钟后弃去上清严格按照细胞裂解液说明书提取蛋白并按说明书用试剂盒法将各组蛋白浓度进行测定根据各组的蛋白浓度，每组取总蛋白加上样缓冲液煮沸后往已准备好的胶板上样根据蛋白分子量大小电泳适当时间，本实验中检测蛋白及内参时，先用恒压电泳使样本位于浓缩胶与分离胶的交接处时，换用恒压电泳至样本缓冲液到达最低端停止电泳万方数据三峡大学硕士学位论文用膜行转膜小时左右将转移后的膜用脱脂牛奶孵育小时后在各自的抗中孵育，漂洗后在对应的二抗室温孵育小时，再用溶液漂。

参考资料：

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