1、疫细胞治疗肿瘤将成为肿瘤免疫治疗的新的思路。家族作为在细胞凋亡中有重要作用的类蛋白质，近几年来得到了广泛的研究。目前已经发现了多个同源基因。家族基因广泛分布于从酵母到哺乳动物等各种动物体中，其通过引起细胞器功能的丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡。等检测了在例乳腺癌中的表达情况，阳性率达到。等检测了在例结肠癌的表达，阳性率达到。其他学者也在多种肿瘤类型中检测到了的阳性高表达。倪志超乌新春等人进行了干扰沉水浴退火，自然冷却至室温，使单链结合形成双链各取退火产物加于水中稀释倍。酶切质粒载体酶切质粒后，质粒两端将形成粘性连接末端，根据下表配置酶切反应体系。表酶切反应体系配比试剂加样量水定容至酶切反应体系经水浴过夜，将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，通过与核酸分子。

2、论文第章绪论研究背景及研究意义癌症是组可影响身体任何部位的多种疾病的统称。它是全球疾病死亡的主要原因之，根据的最新报道，截止到年癌症共造成万人死亡，其中肺癌万例死亡是最主要的致死癌症。年美国有高达万的肺癌发病患者，约有万人每年死于肺癌。从全球的数据来看，肺癌的发病率和死亡率仍处于上升状态年美国有高达万的肺癌发病患者，约有万人每年死于肺癌。从全球的数据它是全球疾病死亡的主要原因之，根据的最新报道，截止到年癌症共造成万人死亡，其中肺癌万例死绪论研究背景及研究意义癌症是组可影响身体任何部位的多种疾病的统称。转录病毒包装细胞的改造质粒表达载体的构建重组质粒的扩增和提取基因载体导入病毒包装细胞沉默效果检测病毒侵染及滴度检测结果讨论本章小结第三章免疫细胞对基因沉默的细胞的。

3、于肿瘤等疾病的治疗。国内外研究进展肿瘤的过表达增强了肿瘤的抗凋亡能力，使得免疫细胞对肿瘤的杀伤受到影响。然而有文献显示，靶向的小分子药物或反义核酸只是使白血病细胞的抗凋亡能力下降，实质上本身并不会导致细胞死亡，真正要使其死亡，还必须配合其他方法来杀死白血病细胞。造血干细胞移植治疗白血病已经成为目前较为可行的治疗白血病的方法。目前仅有不多的通过靶向抑制肿瘤细胞结合免疫细胞治疗肿瘤的研究报道，实验者用抗凋亡蛋白等的小分子化合物联合免疫细胞进行抗肿瘤研究，发现能使肿瘤细胞更敏感的与抗原特异性的免疫细胞作用，但是可能是掺入后抑制肿瘤的同时也抑制了免疫细胞的抗凋亡蛋白，使得免疫细胞的肿瘤杀伤效果不明显。随着以为代表的抗凋亡蛋白及细胞治疗研究的深入，靶向抑制抗凋亡蛋白结合。

4、研究表明，肺癌是种易出现转移的恶性肿瘤，同时采用多种治疗方法包括手随着我国经济的发展，空气质量不断恶化，青少年的吸烟人数持续增加，我国的肺癌发病人数和死亡人数将会继续呈现上升态势。机体的抗肿瘤免疫机制包括细胞免疫和体液免疫，细胞干扰性小，是干扰作用得以发生的中间效应分子。它是类长度大约为个核酸的双链分子，能够与目标序列同源结合。其作用的主要过程是，双链的在细胞内核酸酶的作用下被裂解成为长度为个核酸分子的双链干扰小，即。的反义链转录形成核蛋白体沉默诱导复合体该复合体能够介导切割目标中与互补配对的序列，从来看，肺癌的发病率和死亡率仍处于上升状态，并以每年的速度递增，而大多数发展中国家还要高出这水平表的学术论文及参加的科研项目综述万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位。

5、链分子，能够与目标序列同源结合。其作用的主要过程是，双链的在细胞内核酸酶的作用下被裂解成为长度为个核酸分子的双链干扰小，即。的反义链转录形成核蛋白体沉默诱导复合体该复合体能够介导切割目标中与互补配对的序列，从而使得靶无法正确表达，达到干扰基因表达的效果。此过程中，又可以作为引物，指导细胞以目标为模板合成新的，再次重复以上过程形成新的，从而使得基因沉默能够长期存在。干扰技术具有很高的特异性，作用过程中的小片段中，个碱基的万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文错配即会大大降低对靶的降解效果，这同时也提高了的安全性。同时，不同生物的存在很大差异，减少了不同物种基因传递的可能。而逆转录病毒介导的能够在细胞中稳定保持，并可随细胞的分裂传递，其存在的这特性有利于将其应用。

6、量比较确定目的条带的位置。目的片段的回收纯化使用纯化回收试剂盒回收片段，回收方法参照试剂盒使用说明书。目的基因与载体质粒连接取合成的双链溶液，酶切的空载体，连接酶，加水至，短暂离心使样品沉于管底，反应溶液连接过夜，构成重组质粒。重组质粒的扩增和提取使用感受态大肠杆菌进行重组质粒的扩增，转化与扩增参照感受态细胞使用说明书，利用抗性筛选克隆系。使用质粒纯化回收试剂盒进行重组质粒的回收,回收方法参照试剂盒使用说明书。基因载体导入病毒包装细胞使用阳离子脂质体将重组质粒和表达质粒转染入包装细胞，操作方法参照使用说明书。包装细胞接种于孔细胞培养板中约个，使用完全培养基培养箱中培养。包装细胞融合至时，取质粒脂质体混合液质粒脂质体万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文加入培。

7、杀伤研究材料与方法结果与结论讨论本章小结万方数据第四章研究工作总结和展望致谢参考文献附录作者在读期间发表的学术论文及参加的科研项目综述万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文第章绪论研究背景及研究意义癌症是组可影响身体任何部位的多种疾病的统称。它是全球疾病死亡的主要原因之，根据的最新报道，截止到年癌症共造成万人死亡，其中肺癌万例死亡是最主要的致死癌症。年美国有高达万的肺癌发病患者，约有万人每年死于肺癌。从全球的数据来看，肺癌的发病率和死亡率仍处于上升状态，并以每年的速度递增，而大多数发展中国家还要高出这水平。随着我国经济的发展，空气质量不断恶化，青少年的吸烟人数持续增加，我国的肺癌发病人数和死亡人数将会继续呈现上升态势。研究表明，肺癌是种易出现转移的恶性肿瘤，。

8、的病毒检测包装细胞产生的病毒对人的细胞的侵染能力以及侵染效果，实验分别将三种不同的质粒组合导入到病毒包装细胞中。待产生病毒后收集上清，用病毒上清侵染细胞。通过流式细胞仪对细胞的表达进行检测，并计算病毒的滴度。结果显示当单独导入表达质粒时，具有荧光的细胞比例为，即产生的病毒上清不能侵染细胞，病毒不具备对人细胞的嗜性。当同时导入表达质粒和表达质粒时，显示具有荧光的细胞比例为，即病毒上清可以少量侵染细胞，表明表达质粒的导入使得病毒包装细胞产生了具有人嗜性的病毒。当同时导入表达质粒和表达质粒和质粒三种质粒后，结果显示具有荧光的细胞比例万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文为，表明病毒上清可以有效侵染细胞，即质粒高效的沉默了蛋白，使得包装细胞包装出更多的人噬性病毒，从。

9、时采用多种治疗方法包括手术化疗放疗等是降低肺癌死亡率提高长期生存率的重要途径。近年来肿瘤的免疫治疗发展迅速，多种免疫细胞及过继免疫治疗应用于肿瘤的治疗。机体的抗肿瘤免疫机制包括细胞免疫和体液免疫，细胞免疫是抗肿瘤的有效方式，体液免疫通常只在种情况下起协同作用如细胞介素。人体正常的免疫系统具有免疫监视功能自然杀伤细胞，细胞毒性淋巴细胞细胞和，自然杀伤细胞细胞都被证明在肿瘤免疫中有重要作用，细胞细胞和肿瘤抗原特异性抗体都具有直接杀伤肿瘤的能力。但是，肿瘤患者体内的免疫环境通常会受到肿瘤的抑制，因此免疫系统无法有效抑制肿瘤的生长。干扰技术，是目前常用的基因沉默技术。干扰现象是生物界普遍存在的现象。干扰性小，是干扰作用得以发生的中间效应分子。它是类长度大约为个核酸的双。

10、全培养基中培养箱培养。当细胞生长至融合时，用胰蛋白酶消化重悬细胞。消化后的细胞计数，用含有谷氨酰胺，青链霉素的完全培养基调整至适当浓度，接种至孔细胞培养板中，每孔约个细胞，于，培养箱中培养过夜。用完全培养基稀释病毒上清至不同浓度后替换原培养基。加入至终浓度为培养箱中培养。使用检测细胞以测定病毒滴度，计算公式如下病毒滴度总细胞数表达细胞比例稀释比例病毒上清体积万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文结果沉默质粒有效的抑制了基因的表达通过实时定量方法对的沉默效果进行检测。转染表达质粒后，通过相应试剂盒分离进行实时定量。结果显示包装细胞中基因与对照组相比沉默效果达到，显示针对于基因的沉默序列能够达到沉默该基因的目的。对照组沉默表达水平图结果包装细胞可以产生侵染人细胞。

11、而更高效的侵染入人细胞细胞。利用上文中公式方法进行计算，得到了病毒的滴度，病毒滴度为。注分别向细胞中导入质粒三种质粒组合。图病毒滴度检测结果万方数据杭州电子科技大学博士硕士学位论文讨论通过结果可以发现，对于相应的沉默效率为，也就是沉默相关的基因依然会有少量的表达，包装细胞仍然会产生少量的鼠噬性病毒。虽然该病毒不能侵染人细胞，但是这提醒我们要有选择的使用对于包装细胞的改造的技术，以提高实验的安全性。实验通过脂质体转染的方式将两种外源基因，沉默基因和表达基因导入到已有的病毒包装细胞中来产生所需的人噬性病毒，达到对包装细胞的改造目的。前文中已经提到脂质体转染的方式存在不易形成稳定表达的克隆系的问题，所以无法保证导入的外源基因能够在受体细胞中持续稳定的存在。在进行多次。

12、养有包装细胞的孔细胞培养板中。转染后，用完全培养基换液。加入嘌呤霉素至终浓度为，继续培养包装细胞。当包装细胞稳定生长后换用低浓度嘌呤霉素维持筛选。包装细胞铺满培养板后，使用胰蛋白酶消化后计数，将细胞冻存备用。沉默效果检测采用公司的试剂收集系统，提取总保存于冰箱中备用。各取总，使用宝生物公司的逆转录酶将其反转录合成。采用试剂盒进行实时定量检测包装细胞中的沉默效果，操作参照试剂盒使用说明书。预变性分钟，循环参数个循环。引物序列如下病毒侵染及滴度检测使用分别将质粒和两种质粒和三种质粒的三种不同的质粒组合转染入改造后的包装细胞，操作方法参照使用说明书。转染后，用完全培养基换液继续培养。后，收集培养基，离心后，分装上清，储存于冰箱备用。取冻存的细胞于水浴中快速解冻，加入。

参考资料：

[1]第三节探索宇宙PPT课件 编号39（第26页，发表于2022-06-25）

[2]第三节探索宇宙PPT课件 编号29（第26页，发表于2022-06-25）

[3]第三节探索宇宙PPT课件 编号33（第26页，发表于2022-06-25）

[4]第三节探索宇宙PPT课件 编号32（第26页，发表于2022-06-25）

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[6]第三节探索宇宙PPT课件 编号24（第26页，发表于2022-06-25）

[7]第三节探索宇宙PPT课件 编号36（第26页，发表于2022-06-25）

[8]第三节探索宇宙PPT课件 编号28（第26页，发表于2022-06-25）

[9]第三节探索宇宙PPT课件 编号42（第26页，发表于2022-06-25）

[10]第一节原电池PPT课件 编号34（第26页，发表于2022-06-25）

[11]第一节原电池PPT课件 编号35（第26页，发表于2022-06-25）

[12]第一节原电池PPT课件 编号35（第26页，发表于2022-06-25）

[13]第一节原电池PPT课件 编号34（第26页，发表于2022-06-25）

[14]第一节原电池PPT课件 编号28（第26页，发表于2022-06-25）

[15]第一节原电池PPT课件 编号32（第26页，发表于2022-06-25）

[16]第一节原电池PPT课件 编号27（第26页，发表于2022-06-25）

[17]第一节原电池PPT课件 编号35（第26页，发表于2022-06-25）

[18]第一节原电池PPT课件 编号32（第26页，发表于2022-06-25）

[19]第一节原电池PPT课件 编号33（第26页，发表于2022-06-25）

[20]第一课我们属于多种群体PPT（人民版）PPT课件 编号39（第10页，发表于2022-06-25）