1、鉴定纯度。上柱图见图图上柱图纯化过程前天晚上用从滤过的单蒸水清洗分子筛柱柱子，第二天早上用继续平衡小时至中午或下午。第二天早上从冰箱拿出菌泥，冰上解冻，菌泥用进行悬浮，超声次超声停。此同时先用滤过的单蒸水洗次，然后用平衡次。待超声好后，离心取上清，稀释后用负压泵抽滤，转到管。同时把平衡好了加入到管，放度层析柜杂交炉结合小时。结合完后，把树脂和蛋白上清转移到重力柱，淌干蛋白上清。然后加清洗次，此间用考马斯亮蓝指示监测至其不变蓝色，堵上重力柱。加约，静置，用约洗至考马斯亮蓝监测不变色，收集洗脱液。用浓缩管浓缩换成至约次，准备上分子筛柱。上样。

2、次，然后用平衡次。待超声好后，离心取上清，稀释后用负压泵抽滤，转到管。同时把平衡好了加入到管，放度层析柜杂交炉结合小时。结合完后，把树脂和蛋白上清转移到重力柱，淌干蛋白上清。然后加清洗次，此间用考马斯亮蓝指示监测至其不变蓝色，堵上重力柱。加约，同时加约酶，放度层析柜杂交炉上酶切过夜约小时。从层析柜中拿出重力柱，用洗至考马斯亮蓝监测不变色，收集酶切后液。用浓缩管浓缩至约次，准备上柱。上柱前先用滤过的单蒸水洗柱然后用浓度的平衡泵，。接着用平衡泵柱，。此时用，波长检测蛋白。用注射器上样，上样流速上样约。然后用冲洗柱子约。然后调好泵进入梯度洗脱。

3、时加约酶，放度层析柜杂交炉酶切过夜约小时。从层析柜中拿出重力柱，用洗至考马斯亮蓝监测不变色，收集酶切后液。用浓缩管浓缩至约次，准备上柱。上柱前先用滤过的单蒸水洗柱然后用浓度的平衡泵，。接着用平衡泵柱，。此时只用波长检测蛋白，用注射器上样。上样流速上样约。然后用冲洗柱子约。然后调好泵进入梯度洗脱模式，泵时蛋白洗脱下来此时电导率约为单位，分管收集管。收集完后，泵梯度进行洗脱所有的结合的蛋白。然后调高流速至用水冲洗柱子，用的酒精冲洗，保存树脂。万方数据三峡大学硕士学位论文收集到的蛋白液，用浓缩管浓缩至，编上号，加甘油保存于号至冰箱，另取制样，。

4、粒回收后的产物再和酶切后产物连接，再转化到感受态细胞中。融合蛋白的小量诱导表达见附录材料。融合蛋白的大量诱导表达，检测重组蛋白的可溶性见附录材料万方数据三峡大学硕士学位论文野生型蛋白纯化及纯化方法摇菌第天晚上划线菌种，第二天早上挑单克隆，至含培养基的摇菌管中，摇约小时，按转接到含用含氨苄青霉素的培养基中培养，采用上面探索好的诱导表达条件诱导表达各蛋白。收菌用，得到菌泥约，菌泥应颜色均匀，白皙。用相应的抽提洗遍，转到管度冻存。诱导表达条件同。纯化过程及条件优化从冰箱拿出菌泥，冰上解冻，菌泥用进行悬浮，超声次超声停。此同时先用滤过的单蒸水洗。

5、进行洗脱所有的结合蛋白。然后调高流速至用水冲洗柱子，用的酒精冲洗，保存树脂。万方数据三峡大学硕士学位论文收集到的蛋白液，用浓缩管浓缩至，编上号，加甘油保存于度冰箱，另取制样，跑鉴定纯度。上柱图见图图上柱图纯化过程及条件优化冰箱拿出菌泥，冰上解冻，菌泥用进行悬浮，超声次超声停。此同时先用滤过的单蒸水洗次，然后用平衡次。待超声好后，离心取上清，稀释用负压泵抽滤，转到管。同时把平衡好了加入到管，放度层析柜杂交炉结合小时。结合完后，把树脂和蛋白上清转移到重力柱，淌干蛋白上清。然后加清洗次，此间用考马斯亮蓝指示监测至其不变蓝色，堵上重力柱。加约，。

6、平衡好的分子筛柱，流速，约小时后，收集第个峰，再过收集第二个峰，第二个峰为目的蛋白。收集到的蛋白液，用浓缩管浓缩至，测浓度。加甘油分管保存量为。保存于度冰箱，另取制样，跑鉴定纯度。万方数据分类号密级公开硕士学位论文单体二聚体转换在生物钟反应体系中的作用的初步研究学位申请人刘松学科专业生物化学与分子生物学指导教师刘森教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或。

7、式，泵梯度蛋白洗脱下来此时电导率约为单位，泵梯度洗脱下来此时电导率约单位，分管收集蛋白管。收集完后，泵用梯度进行洗脱所有的结合在树脂上的蛋白。然后调高流速至用水冲洗柱子，用的酒精冲洗，保存树脂。收集到的蛋白液，用浓缩管浓缩至，编上号，加除菌甘油保存于度冰箱，另取制样，跑鉴定纯度。上柱图，如图万方数据三峡大学硕士学位论文图上柱图纯化过程及条件优化从冰箱拿出菌泥，冰上解冻，菌泥用进行悬浮，超声次超声停。此同时先用滤过的单蒸水洗次，然后用平衡次。待超声好后，离心取上清，稀释用负压泵抽滤，转到管。同时把平衡好了加入到管，放度层析柜杂交炉结合小时。

8、性质，聚合状态进行初步鉴定。得到高纯度的蛋白后体外重组反应，验证活性。用蛋白相互作用仪器测不同形式的相互作用常数。根据蛋白的特征，设计及构建特定聚合体状态的蛋白表达质粒，分别命名为，表达纯化，蛋白，用分子筛分析对其初步理化性质，聚合状态进行研究。分别用，蛋白和，进行相互反应，研究其对体外生物振荡体系的磷酸化影响。用蛋白相互作用仪器测不同形式的相互作用常数。结果成功纯化出高纯度的蛋白。体外相互作用磷酸化实验表明纯化的有定的活性，体外磷酸化振荡体系初步建立。成功构建特定聚合体状态的蛋白表达质粒和。表达纯化出蛋白，并对其般理化性质研究电泳实验。

9、结合完后，把树脂和蛋白上清转移到重力柱，淌干蛋白上清。然后加清洗次，此间用考马斯亮蓝指示监测至其不变蓝色，堵上重力柱。加静置后洗脱，总体积约，洗至考马斯亮蓝监测不变色，收集洗脱液。用浓缩管浓缩并换成至约次，此时加约酶，放度层析柜杂交炉酶切过夜约小时。此粗纯蛋白液用规格进行换，换成准备上柱。上柱前先用滤过的单蒸水洗柱然后用浓度的平衡泵，。接着用平衡泵柱，。此时用，波长检测蛋白。用注射器上样。上样流速上样约。然后用冲洗柱子约。然后调好泵进入梯度洗脱模式，泵蛋白洗脱下来此时电导率约为单位，分管收集管。泵洗脱下来此时电导率约单位。收集完后，泵梯。

10、背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的以蓝藻生物钟蛋白为研究对象，初步探索蛋白体外反应体系中蛋白聚合体是否有单体二聚体形式转换过程，其聚合体状态对反应体系是否有影响如何影响以期解决蛋白体外反应体系中参与的过程中些不清楚的问题，从蛋白质相互作用方面为我们更好地解析蓝藻体外核心生物振荡体系的运转机制提供借鉴，也为真核生物的生物钟研究提供启示。方法通过蛋白质分析序列比对软件，结构分析软件，参考文献分析的特征。利用原核质粒表达高纯度的蛋白，用亲和层析，离子交换层析进行蛋白纯化，并对其般理。

11、明其行为不同于，和电泳表现不同的电泳特性，分析柱分析蛋白分子量比四聚体状态大点点约为。初步的和，磷酸化相互反应实验表现为失去明显的磷酸化振荡。得到和的相互作用常数为。结论成功建立起纯化蛋白的方法，能得到高纯度和定活性的蛋白。初步建立起体外万方数据三峡大学硕士学位论文磷酸化相互反应体系。构建出了特定状态的蛋白，蛋白设计与实验符合程度较大。从特定状态的的性质动力学常数磷酸化振荡等实验初步证明参与体外磷酸化振荡体系时，其会出现聚合体单体转换过程，单体出现的过程是其和发生直接相互作用的必要条件。关键词单体转换聚合状态万方数据三峡大学硕士学位论文。

12、写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因。

参考资料：

[1]绘本故事：秋秋找妈妈（优） 编号18060（第14页，发表于2022-06-24）

[2]绘本故事：秋秋找妈妈（优） 编号18060（第14页，发表于2022-06-24）

[3]绘本故事：秋秋找妈妈（优） 编号18060（第14页，发表于2022-06-24）

[4]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[5]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[6]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18042（第22页，发表于2022-06-24）

[7]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[8]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[9]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18054（第22页，发表于2022-06-24）

[10]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[11]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[12]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[13]绘本故事：是谁嗯嗯在我的头上（优） 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[14]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）

[15]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）

[16]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18078（第35页，发表于2022-06-24）

[17]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）

[18]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）

[19]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）

[20]绘本故事：我的名字克丽桑丝美美菊花（优） 编号18060（第35页，发表于2022-06-24）